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肝细胞癌是世界第五大流行癌症,致死率非常高。慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染被认为是诱发肝癌的主要因素。研究发现HBV基因组x基因编码的X蛋白(hepatitsis B virus X protein, HBx)在HBV复制和诱发肝癌过程中具有重要作用。课题组前期对HBx转基因小鼠SILAC (Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture)定量蛋白质组学研究发现,在HBx诱发小鼠肝脏由重度炎症转变为癌症过程中,CDC42信号通路相关分子及CDC42蛋白本身蛋白表达量上调,提示在HBx诱发小鼠肝癌过程中,CDC42信号通路被激活。激活的CDC42可参与多条信号通路,引起细胞骨架、细胞周期、细胞侵袭转移能力等改变。为了解CDC42蛋白是否参与以及如何参与HBx介导的Huh7细胞恶性转化,本研究首先通过CRISPR/Cas9技术对Huh7-HBx细胞中的CDC42基因进行修饰,而后通过添加CDC42特异性抑制剂CASIN抑制Huh7-mock细胞和Huh7-HBx细胞中CDC42活性,探究CDC42功能破坏时HBx介导的Huh7恶性转化程度变化,进而揭示CDC42在HBx诱发人肝细胞恶性转化中的作用。研究结果将为深入理解HBV致癌机制、寻找HBV相关肝癌的治疗靶标提供理论依据。具体研究结果如下：1.HBx介导Huh7细胞恶性转化为了解HBx基因的异常表达是否可引起人肝癌细胞系Huh7细胞系的恶性转化,首先应用实时定量PCR检测Huh7-mock细胞和Huh7-HBx细胞中HBx基因表达情况,采用CCK-8试剂盒检测2种细胞的增殖能力、Annex V和FITC试剂盒检测细胞凋亡水平,并通过细胞划痕实验检测HBx基因转染前后Huh7细胞迁移能力的变化情况。结果显示：(1)Huh7-HBx细胞中HBx基因的表达显著高于Huh7-mock细胞(p<0.01)；(2)Huh7-HBx细胞的增殖能力显著高于Huh7-mock细胞(p<0.01)；(3)Huh7-HBx细胞的抗凋亡能力显著高于Huh7-mock细胞(流式细胞仪分析)。(4)Huh7-HBx细胞的迁移能力高于Huh7-mock细胞；(5)与Huh7-mock细胞相目比,Huh7-HBx细胞中CDC42蛋白表达量升高(Western blot分析)。2.HBx介导Huh7细胞恶性转化依赖CDC42为了验证CDC42蛋白是否参与HBx介导的Huh7细胞恶性转化,首先应用CRISPR/Cas9系统对Huh7-HBx细胞中CDC42基因进行编辑,检测CDC42基因敲除前后细胞的增殖能力、凋亡水平及迁移能力,而后采用CDC42蛋白特异性抑制剂CASIN处理Huh7-mock细胞和Huh7-HBx细胞,了解其对细胞增殖及凋亡水平的影响。结果发现：(1)获得在CDC42基因第二外显子处具有4个碱基缺失的突变体细胞(Huh7-HBx CDC42 KO);(2)Huh7-HBx CDC42 KO细胞增殖能力显著低于Huh7-HBx细胞(p<0.01)；(3)Huh7-HBx CDC42 KO细胞群体中晚期凋亡细胞比例升高,即细胞抗凋亡能力显著下降；(4)Huh7-HBx CDC42 KO细胞的迁移能力低于Huh7-HBx细胞；(5)不同浓度CASIN处理一定时间后,Huh7-HBx细胞的增殖能力显著降低(p<0.01),而Huh7细胞的增殖能力没有显著变化；Huh7-HBx细胞的抗凋亡能力显著下降(p<O.01),而Huh7细胞抗凋亡能力在抑制剂处理前后没有显著变化。3.CDC42参与HBx介导Huh7细胞恶性转化的定量蛋白质组研究为了鉴定参与HBx介导Huh7细胞恶性转化的CDC42蛋白下游效应因子,利用基于质量亏损的准等重二甲基标记技术分别对Huh7-mock细胞和Huh7-HBx细胞的全蛋白在肽段水平进行化学标记,混合后的肽段经离线液相分离,Q Exactive HF质谱仪进行质谱检测,pFind3.0搜索引擎处理数据。结果显示：(1)在Huh7-HBx(30L)和Huh7-HBx CDC42 KO (30H)组数据中,共定量到4436个蛋白,其中差异蛋白为523个,上调蛋白为239个,下调蛋白共284个；(2)下调蛋白的功能主要聚集在细胞死亡、细胞凋亡等途径；(3)IQGAP1蛋白作为CDC42的下游效应因子可能参与了HBx介导的Huh7细胞恶性转化。以上研究结果表明,HBx进入Huh7细胞后,通过调控CDC42蛋白活性,使其与IQGAP1结合,导致Huh7细胞的分裂、增殖等生命活动发生紊乱,最终导致了Huh7细胞恶性化程度的升高。本研究结果提示HBx/CDC42/IQGAP1信号通路在HBx诱发肝细胞恶性转化中可能具有重要作用,也许是HBV致癌的一种新机制。