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背景:慢性阻塞性肺疾病是以不完全可逆的气流受限为特征的阻塞性肺病。急慢性炎症交替持续存在,造成气道重构和肺气肿,表现为劳力性呼吸困难等,为患者的日常生活和社会带来沉重负担。中医药治疗慢阻肺不仅可缓解症状,还能减少急性加重,延缓疾病进展,而其机制缺乏深入研究。黏膜免疫具有重要作用,但中医药对呼吸道黏膜免疫影响机制的研究数量少、处于起步阶段。固本止咳中药方是一个针对慢阻肺稳定期的病机特点,具有扶正祛邪之功效的经验方。前期临床研究表明其能够缓解患者的症状、提高肺功能、调节免疫功能。动物实验研究显示其能够减轻慢阻肺模型小鼠气道炎症,改善肺功能和病理损伤,机制有待进一步研究。目的:1.研究固本止咳中药方对呼吸道黏膜免疫中关键细胞γ δT细胞及其细胞因子KGF的影响,探究其对黏膜免疫功能的影响及扶正祛邪的机制。2.研究固本止咳中药方对循环中及黏膜局部炎症因子的影响,探讨其改善患者症状及疾病进展严重程度的机制。3.为黏膜免疫功能与“卫气”之间的联系、为中医药以扶正固本实现“治未病”以及为从调节黏膜免疫入手治疗慢阻肺提供实验依据。方法:按照固本止咳中药方制作干浸膏,配制成高剂量0.55g生药/ml、中剂量0.28g生药/ml、低剂量0.09g生药/ml。将125只SPF级ICR雌性小鼠随机分为5组:空白对照组、模型对照组、固本止咳中药方高、中、低剂量组,每组25只。采用持续香烟烟雾暴露12周(除第1、29、57天)加经鼻腔向呼吸道滴入LPS溶液(第1、29、57天,共3次)的方法建立慢阻肺小鼠模型,而后两对照组用蒸馏水、中药组用固本止咳中药方溶液灌胃,共4周。造模及药物干预过程中观察其一般生理活动,监测体重。灌胃结束后用小动物肺功能仪测量肺功能。肺组织切片HE染色后观察形态学改变及细胞浸润,评价小鼠造模效果;肺组织切片进行免疫组化染色,检测小鼠肺组织中α βTCR和γ δ TCR表达情况、KGF和KGFR分泌情况;参考小肠黏膜上皮细胞间淋巴细胞分离方法,总结出肺组织淋巴细胞分离方法,用流式细胞术分析其中的αβT细胞和γ δ T细胞群;肺组织匀浆后采用Western Blot方法检测其中的KGF和KGFR蛋白,应用ELISA方法检测KGF蛋白含量,并用RT-PCR法检测KGF的mRNA水平;收集小鼠的血清、支气管肺泡灌洗液和肠黏液,用ELISA方法检测其中的炎性因子IL-6和IL-13水平。结果:1.一般生命质量情况:空白对照组小鼠无死亡,皮毛光泽柔顺,呼吸和缓,频率适中,节律均匀,活动正常,体重逐渐增加;慢阻肺模型组小鼠死亡10只,毛发枯暗,部分有脱毛,熏烟时躁动蹿跳,后期多扎堆蜷缩,甚则全身颤抖,呼吸急促,胸腹部起伏明显,时有不规则点头运动,甚者张口呼吸,体重较空白组明显偏低(P<0.001)。高剂量、中剂量固本止咳中药方组分别死亡1只,低剂量固本止咳中药方组死亡4只,造模期间一般情况同慢阻肺模型组,给予中药灌胃后与模型组相比毛发较顺泽,躁动程度有所减轻,呼吸困难可见改善,频率减缓,高剂量、低剂量固本止咳中药方组体重明显高于模型组(P<0.001)。2.肺组织切片HE染色显示空白对照组小鼠气道和肺泡结构正常,纤毛整齐,肺泡形状、大小规整,气道黏膜上皮完整;模型对照组支气管黏膜皱襞形成、有片状脱落,使管腔变窄或闭塞;肺泡壁破坏,肺泡腔不规则扩大,部分融合成肺大泡,气道周围及肺间质可见炎症细胞浸润,符合慢阻肺病理学表现。经固本止咳中药方治疗的三组与模型对照组对比,可见形态学方面的改善,体现在支气管和肺泡结构较完整,管腔狭窄程度减轻,气道黏膜上皮相对完整,纤毛排列规则、脱落减少,肺泡大小比较均匀,肺大泡数量减少,气道管壁周围及肺间质内炎症细胞浸润程度减轻。3.肺功能测量:模型对照组呼吸系统粘性阻力、弹性阻力明显高于空白对照组(P<0.05);呼吸系统动态顺应性明显低于空白对照组(P<0.05)。高、中、低剂量固本止咳中药方组呼吸系统粘性阻力明显低于模型对照组(P<0.05);中剂量固本止咳中药方组弹性阻力明显低于模型对照组(P<0.05)、呼吸系统动态顺应性明显高于模型对照组(P<0.05)。肺组织阻尼模型对照组明显高于空白对照组(P<0.05);高剂量、低剂量中药组明显低于模型对照组(P<0.05)。准静态顺应性高剂量固本止咳中药方组明显高于模型对照组,准静态弹性量高剂量固本止咳中药方组明显低于模型对照组(P<0.05)。4.肺组织免疫组化染色实验中,空白对照组可见α β T细胞、γ δT细胞均少量存在于肺组织中;模型对照组几乎未见γ δT细胞存在;高、中、低剂量固本止咳中药方组,可见较多γ δ T细胞存在于气管附近,较模型组有明显升高,小鼠肺组织α β T/γ δT细胞比例在模型组较空白对照组升高,固本止咳中药方组较模型组呈降低趋势。5.肺组织淋巴细胞流式分析:小鼠γδT细胞比例在模型组较空白对照组有降低的趋势,低剂量固本止咳中药方组较模型组有明显升高(P<0.05)。6.肺组织切片免疫组织化学染色,空白对照组肺组织中有少量KGF表达;模型对照组少于空白对照组;高、中、低剂量固本止咳中药方组KGF表达明显高于模型组,且稍高于空白对照组。7.Western blot检测结果显示,KGF、FGFR2蛋白表达量模型对照组较空白对照组明显降低(P<0.05),中剂量固本止咳中药方组KGF表达较模型对照组明显升高(P<0.05),高剂量固本止咳中药方组、低剂量固本止咳中药方组FGFR2表达较模型对照组明显升高(P<0.05)。8.ELISA检测结果显示,高剂量固本止咳中药方组KGF蛋白含量较模型对照组明显升高(P<0.05)。9.Real Time PCR检测结果显示,KGF蛋白的mRNA含量模型对照组明显低于空白对照组,中、低剂量中药组明显高于模型对照组(P<0.05)。10.小鼠血清中的IL-6含量慢阻肺模型对照组高于空白对照组(P<0.05),高剂量中药组低于模型对照组(P<0.05);血清中的IL-13含量各组间未见明显差异。BALF中的IL-6含量慢阻肺模型对照组高于空白对照组(P<0.05);高剂量中药组与模型组对照组对比无统计学差异,中剂量中药组低于空白对照组、模型对照组以及高剂量中药组(P<0.05),低剂量中药组低于空白对照组、模型对照组以及高剂量中药组(P<0.05);BALF中的IL-13含量慢阻肺模型对照组高于空白对照组(P<0.05),高剂量中药组以及中剂量中药组低于模型组对照组(P<0.05)。肠黏液中的IL-6含量各组间未见明显差异;肠黏液中的IL-13含量慢阻肺模型对照组高于空白对照组(P<0.05),高、中、低剂量中药组低于模型组对照组(P<0.05)。结论:1.持续香烟烟雾暴露加经鼻腔向呼吸道内滴入LPS溶液的方法造成小鼠肺部形态学病理改变以及肺功能改变与慢阻肺的特征相吻合。2.固本止咳中药方由黄芪、淫羊藿、炒白术、百部、黄芩、赤芍、防风组成,其可以提高慢阻肺模型小鼠生命质量及体重。3.固本止咳中药方可以改善慢阻肺模型小鼠肺组织形态学病理变化。4.固本止咳中药方治疗可减轻慢阻肺模型小鼠呼吸道阻塞程度、提高肺组织顺应性。5.固本止咳中药方明显减低慢阻肺模型小鼠血清和BALF中的IL-6含量以及BALF和肠黏液中的IL-13含量,有效控制气道及全身炎症状态,改善气道及肺组织结构损伤。6.固本止咳中药方通过调节慢阻肺模型小鼠肺组织γ δT细胞比例,促进KGF及KGFR的分泌,加快肺组织损伤的修复,起到改善呼吸道黏膜完整性、增强黏膜免疫功能的作用。与固本止咳中药方通过扶正祛邪、补气助阳、健脾益肾、止咳化痰、活血化瘀,从而增强“卫气”的作用彼此呼应。据此推测,呼吸道黏膜免疫功能是“正气卫外”作用的物质基础之一,中医药通过调节黏膜免疫功能,实现“扶正祛邪”的作用,从而达到延缓疾病进展、减少急性发作的目的,为慢阻肺的治疗提供了新的思路。7.根据肠上皮细胞间淋巴细胞提取方法,在本研究中总结并完善的肺组织淋巴细胞提取分离的实验操作方法,也将为呼吸道黏膜免疫的研究提供实验基础。