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以农杆菌介导直接转化植物的BIBAC载体的发展,加速了植物基因组研究,基因图位克隆和基因的功能分析。生物体的许多重要性状牵涉到复杂的生理生化反应,是受多基因或基因簇的控制,而且植物在同一信号途径上实现其抗盐机制相关的基因可能成簇存在。基于这一假设,构建了盐生植物小盐芥(Thellungiellahalophila)大片段DNA的基因组文库:BIBAC文库。这个文库的建成,可以实现成簇或者同一信号途径上面的许多基因的同时转化,并且为发现与小盐芥耐盐相关基因提供可能。
本研究通过根癌农杆菌介导,将带有分子量为50-100kb的小盐芥基因组片段插入到拟南芥(Arabidopsisthaliana)的基因组中,得到20个转基因株系。通过对转基因植株进行抗盐分析,得到比野生型和其他的转基因株系有更好的耐盐能力的转基因植株BAC256。在此基础上,对该产生抗盐植株的小盐芥DNA大片段进行亚克隆分析,以确定其中的耐盐基因。在亚克隆分析过程中,首先使用有六个识别位点的限制性内切酶BamHI把BAC256中的插入片段完全酶切成5个较大的片段,并与植物载体pCAMBIA1300构建亚克隆;与此同时,为了避免由于用BamHI酶切时,可能破坏插入片段中的耐盐基因,用只有四个识别位点的限制性内切酶Sau3AI部分酶切BAC256,选取一定大小范围(4-6kb)的部分酶切片断,将其与植物载体pCAMBIA1300构建小片段亚克隆。通过转化有足够的覆盖倍数的亚克隆,便可以把由于BamHI的酶切可能造成的耐盐基因破坏这一问题解决。在获得的80个亚克隆转基因植物中,通过耐盐分析最后发现其中被BamHI酶切产生的亚克隆BAC256-1有较野生型和其他的转化株系有明显的耐盐能力。
BIBAC文库中抗盐基因的筛选和亚克隆分析,证明了利用BIBAC文库寻找盐生植物的抗盐基因和研究抗盐机制是可行的。