【摘 要】
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目的:构建携带肾癌特异性启动子碳酸酐酶IX(Carbonic Anhydrase IX,CAIX)和人源化绿色荧光蛋白(humanized renilla reniformis Green Fluorescent Protein,hrGFP-1)报告基因
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目的:构建携带肾癌特异性启动子碳酸酐酶IX(Carbonic Anhydrase IX,CAIX)和人源化绿色荧光蛋白(humanized renilla reniformis Green Fluorescent Protein,hrGFP-1)报告基因的不依赖CAR的复制缺陷型5型重组腺病毒Ad5/f11-CAIX-E1A-hr GFP-1,建立检测肾癌患者外周血中循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)的新方法,为临床治疗提供理论依据。方法:分别双酶切pShuttle-CMV-hrGFP-1、pShuttle-CAIX-E1A获得hrGFP-1目的基因片段和载体基因片段,T4 DNA连接酶过夜连接,构建重组穿梭质粒pShuttle-CAIX-E1A-hr GFP-1,摇菌并提取质粒。质粒经PCR鉴定,鉴定证实构建正确的质粒经PmeI酶切线性化,与骨架质粒AdEasy-1/f11p依次转化入感受态BJ5183细菌,通过同源重组技术构建重组腺病毒质粒pAd5/f11-CAIX-E1A-hr GFP-1。将经PCR、酶切鉴定证实构建正确的重组腺病毒质粒,转化入感受态DH5a细菌扩增、保存。阳性质粒经PacI酶切后,转染HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad5/f11-CAIX-E1A-hr GFP-1,经4轮扩增后纯化病毒,检测其滴度。结果:经PCR、酶切鉴定,证实重组穿梭质粒pShuttle-CAIX-E1A-hrGFP-1、重组腺病毒质粒pAd5/f11-CAIX-E1A-hrGFP-1构建正确;经4轮扩增后纯化,测定重组腺病毒的滴度为2.36×109pfu/ml。结论:不依赖CAR的肾癌组织特异性复制缺陷型重组腺病毒Ad5/f11-CAIX-E1A-hr GFP-1构建成功,为检测肾癌患者外周血中循环肿瘤细胞提供新的方法,对早期发现肾癌的恶性侵袭、判断肾癌分期、预后、指导个体化治疗及疗效评价等具有重要意义。
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