本文主要从以下几部分展开： 第一部分隐丹参酮对氨所致新生大鼠脑皮层神经元损伤的保护作用及其机制研究 阿尔茨海默病，是一种进行性发展的中枢神经系统退行性疾病。AD的发病原因及其机制尚不明确，目前认为该病是遗传、代谢和环境等综合因素相互作用所致，相继提出了胆碱能学说、β-淀粉样蛋白学说、基因突变学说、自由基损伤学说、兴奋性氨基酸毒性学说及炎性反应学说等。近年来，氨毒性及细胞凋亡在AD发病中的重要作用日益受到重视。体外研究证实，氨能诱导神经细胞凋亡，而抑制Akt或MAPK信号通路是其促进神经元凋亡的主要机制。 中医药的现代研究表明很多中药对中枢神经系统有保护作用，本实验室前期研究发现隐丹参酮能与氨、苯乙胺和苯乙醇胺等在温和条件下反应生成无毒的代谢产物，在体实验研究结果表明隐丹参酮对高氨诱导的肝性脑病动物模型神经损伤具有保护作用。为了更加深入研究和明确氨在神经系统疾病中的毒性作用以及隐丹参酮的保护作用机制，本实验拟在体外培养原代大鼠脑皮层神经元的基础上，探讨隐丹参酮对氨诱导的神经损伤的保护作用，明确其保护作用的细胞内信号传递机制。同时观察隐丹参酮对Aβ以及谷氨酸诱导神经损伤的保护作用，旨在为AD发病机制的探索和新药的开发提供理论依据。 目的： 1.观察氨对大鼠脑皮层神经元的影响，初步探讨氨对神经细胞的损伤机制。 2.观察隐丹参酮对氨诱导的大鼠脑皮层神经元损伤的保护作用，并探讨其神经保护作用机理。 方法： 体外培养大鼠脑皮层神经元，隐丹参酮预给药1h，荡洗后加入终浓度为10mM的氨继续培养24h，应用MTT、LDH、形态学方法检测细胞存活；用Hoechst染色及流式细胞仪技术检测细胞凋亡；通过WesternBlot法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3和Akt蛋白表达变化。 结果： 1.体外培养出高纯度大鼠脑皮质神经元，采用神经元特异标志物MAP-2对神经元进行免疫组化鉴定，其中皮层细胞纯度达95％以上。 2.成功建立体外神经元细胞损伤模型。氨对脑皮层神经元的毒性作用有明显的剂量、时间依赖关系，随着氨浓度的增加和作用时间延长，其毒性作用增强。10mM氨与脑皮层神经元共培养24h，可造成神经元损伤模型。 3.采用MTT法、LDH法、细胞形态学观察、Hoechst染色以及流式细胞检测评价隐丹参酮对氨诱导的皮层神经元凋亡的抑制作用，结果显示，10mM的氨与皮层神经元共孵育24h可诱导皮层神经元凋亡，隐丹参酮有明显的抗细胞凋亡作用。 4.用WesternBlot方法检测细胞凋亡相关蛋白的表达，隐丹参酮可明显促进抗凋亡因子Bcl-2表达、减少促凋亡因子Bax表达，提高Bcl-2/Bax的比值，抑制Caspase-3的激活。 5.用LY294002和PD98059分别阻断相应的P13K信号通路及ERK通路，发现LY294002能够明显减弱隐丹参酮对凋亡神经元的保护作用，而PD98059无此作用。 6.WesternBlot结果显示隐丹参酮可剂量、时间依赖性的激活氨抑制的磷酸化Akt蛋白的表达。 7.隐丹参酮能减轻由200mM谷氨酸以及25μMAβ25-35诱导的脑皮层神经元的损伤，其作用可分别被LY294002和PD98059所减弱。 结论： 1.本实验建立的新生大鼠脑皮层神经元培养方法，可得到纯度较高的神经元，为揭示神经元、神经网络超微结构及神经元生理、生化和病理等方面的复杂变化和研究神经药理学提供了便利。 2.10mM氨作用24h对体外培养的大鼠皮层神经元具有明显的毒性作用，后续实验选择10mM氨与皮层神经元共孵育24h建立细胞损伤或凋亡模型。 3.隐丹参酮预给药1h，可剂量依赖性的抑制氨诱导的神经细胞凋亡。其作用机理为：促进抗凋亡因子Bcl-2表达，减少促凋亡因子Bax表达，提高了Bcl-2/Bax的比值，从而抑制Caspase-3激活，最终免于细胞凋亡。 4.PI3K/Akt信号传导通路参与了隐丹参酮拮抗氨诱导皮层细胞损伤的保护作用。 5.隐丹参酮对谷氨酸及Aβ25-35诱导的神经细胞损伤也具有保护作用，其作用分别是由P13K/Akt和MAPK/ERK通路所介导的。 第二部分隐丹参酮对AD转基因模型小鼠保护机制的研究 目的： 运用现代分子神经病理学和行为学技术，围绕淀粉样蛋白瀑布流假说、炎症假说、氨假说，着眼于AD的关键病理机制Aβ沉积及其代谢，开展隐丹参酮对AD转基因模型小鼠保护作用研究，从而探讨其防治AD的机理。 方法： 选甩APP/PS1双转基因小鼠模型，将其随机分为5组，另取同窝阴性小鼠作为正常对照组，每组动物10只，三个月龄后开始给药。(1)对照组：同窝阴性小鼠，每天灌胃给予等量的0.5％羧甲基纤维素钠；(2)模型组：转基因小鼠，每天灌胃给予等量的0.5％羧甲基纤维素钠；(3)隐丹参酮低剂量组：转基因小鼠，每天灌胃给予5mg/kg剂量的隐丹参酮；(4)隐丹参酮中剂量组：转基因小鼠，每天灌胃给予15mg/kg的隐丹参酮；(5)隐丹参酮高剂量组：转基因小鼠，每天灌胃给予45mg/kg的隐丹参酮；(6)哈伯因组：转基因小鼠，每天灌胃给予0.04mg/kg的哈伯因。每周测体重，按体重调整用药剂量，给药4个月后，通过行为学实验测试小鼠学习记忆能力的变化。处死小鼠，留取血浆、大脑皮层和海马组织。应用ELISA试剂盒测定脑组织和血浆Aβ40，Aβ42水平；免疫组织化学染色法进行脑组织Aβ沉积、突触素表达、星形胶质细胞、小胶质细胞活性的检测；应用WesternBlot法检测APP、α-CTF、β-CTF的表达差异；荧光法测α、β、γ分泌酶的活性；RT-PCR法检测Aβ降解酶NEP酶和IDE酶转录表达变化以及用血氨仪检测体内氨水平的变化。 结果： 1.Morris水迷宫实验显示，AD模型小鼠逃避潜伏期较正常组明显延长，原象限停留时间明显缩短。避暗实验中AD模型小鼠的避暗潜伏期缩短，错误次数明显增加。 2.Morris水迷宫实验显示，隐丹参酮组小鼠逃避潜伏期较模型组明显缩短，原象限停留时间明显延长。避暗实验中隐丹参酮组小鼠的避暗潜伏期延长，错误次数明显减少。 3.免疫组化和ELISA试剂盒测试结果显示，AD模型小鼠脑组织Aβ斑块沉积以及不可溶性Aβ40和Aβ42水平较正常组明显增加，隐丹参酮可剂量依赖性的减少脑组织Aβ斑块的沉积和不溶性Aβ40、Aβ42的水平，同时增加Aβ在血浆中和脑组织中的比值。 4.免疫组化和图象分析半定量检测显示，与正常组比较，AD模型小鼠脑组织突触素表达明显减少，星形胶质细胞和小胶质细胞表达明显增加；隐丹参酮可剂量依赖性的促进突触素表达，减少星形胶质细胞和小胶质细胞的表达。 5.WesternBlot结果显示，AD模型小鼠脑组织APP、β-CTF的表达较正常组明显升高，α-CTF表达轻微上调，隐丹参酮对APP、β-CTF的表达没有影响，但能明显上调α-CTF的表达。 6.酶活性检测结果显示，与正常组比较，AD模型小鼠脑组织α分泌酶活性降低，β分泌酶和γ分泌酶活性增加，隐丹参酮能剂量依赖性的增加α分泌酶活性，对β分泌酶和γ分泌酶活性没有影响。 7.RT-PCR结果显示，与正常组比较，AD模型小鼠脑组织Aβ降解酶表达异常，其中NEP酶mRNA表达明显降低，而IDE酶mRNA表达略微上调，隐丹参酮对NEP酶和IDE酶的mRNA表达均无明显影响。 8.血氨仪检测结果表明，AD模型小鼠血氨及脑组织氨水平较正常组明显增加，隐丹参酮能够剂量依赖性的降低异常增高的血氨及脑氨水平。 结论： 1.AD转基因小鼠七个月后发展有明显学习记忆功能障碍，伴有脑组织Aβ大量沉积、突触丢失、胶质细胞活化和APP代谢异常等AD的特征性病理改变，符合AD临床特点，是较理想的AD动物模型。 2.隐丹参酮对AD模型小鼠学习记忆障碍具有明显改善作用，并且可剂量依赖性的显著降低脑组织Aβ斑块沉积和不可溶性Aβ40、Aβ42水平，升高Aβ在血浆中和脑组织中的比值。同时可剂量依赖性的增加脑组织突触的数量，抑制对胶质细胞的激活，从而延缓AD的病理进展。 3.隐丹参酮对AD模型小鼠异常表达的相关基因具有治疗调控作用。其上调α分泌酶的活性，增加α-CTF片段表达，从而减少Aβ在脑内的产生，可能是隐丹参酮神经保护作用的重要机理之一。 4.隐丹参酮降低脑组织氨及血氨水平可能是其作用的机理之一。