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北京市农林科学院植环所从京郊菜园土壤中分离到一株拮抗细菌,代号P一16l。初步试验证明其有较好的生防潜力。本文从菌株的拮抗性、对甘蓝枯萎病的温室防效、菌株的鉴定、摇瓶发酵培养基筛选、发酵条件优化和发酵液基本理化特性等方面进行了比较系统的研究。主要结论如下。
1.对峙培养结果表明,P-161菌株对供试的甘蓝枯萎病菌等16种植物病原真菌的抑菌带均较明显,抑菌带宽度达6.6mm~12.5mm,说明P-161菌株对这些病原真菌都具有明显的抑制作用。其中P-16l菌株对甘蓝枯萎病菌的抑菌带宽度达8.3mm,辣椒炭疽病菌抑制作用最强,抑菌带宽度达12.5mm;P-161菌株对玉米大斑病菌、小麦纹枯病菌、桃褐腐病菌和茄子早疫病菌的抑菌带都在9.0mm以上,抑菌效果较为理想。温室试验结果表明,P-161菌株对甘蓝枯萎病于12天和20天的防治效果分别为96.25%和74.89%,对甘蓝枯萎病的控制作用是非常有效的,其结果较为理想。
2.根据《伯杰细菌鉴定手册》(第9版,1994)和《微生物分类学》的有关细菌分类鉴定标准,综合分析评价P-161菌株的菌体形态、培养特征、生物学性状及生理生化性质,与芽孢杆菌菌种的检索表及相关特征比较,P-161菌株与枯草芽孢杆菌的主要鉴别特征基本一致,符合枯草芽孢杆菌在分类地位上的基本要求。由此,初步将P-161菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
3.经试验证明,P-161菌株对引起黄瓜、甘蓝和西瓜枯萎病的尖孢镰刀菌的抑制大体上是由竞争作用和拮抗作用所致。其中较为重要的是P-161菌株通过分泌某种拮抗物质造成病原菌孢子萌发受抑制、畸形;菌丝溢缩变细、菌体内涵物泄漏中空甚至彻底崩解。P-161菌株对病原菌的竞争作用是很明显的,它可能在实际控病中起到重要作用。
4.本研究采用均匀设计与正交设计试验,最终明确了P-161菌株最合适的产抗培养基及工业发酵培养基。实验室产抗培养基的配方为:牛肉膏1%,葡萄糖1.3%,蛋白胨1.9%,酵母粉0.2%,NaCl 0.6%;工业发酵培养基的配方为:玉米粉1.2g,豆饼粉3.0g,K<,2>HPO<,4>·3H<,2>O 0.4g。明确了P-161菌株最佳发酵培养条件为:种龄21-24h,接种量5%,初始pH 6,温度35℃,瓶装量50ml/500ml,摇床转速180r/min,发酵周期72h。通过对发酵培养基的筛选及培养条件的优化,相比原始发酵培养基,发酵液抑菌活性及活菌体均有显著的提高。
5.P-161菌株产生的抑菌活性物质在不同光、热、酸、碱环境下的稳定性试验表明,P-161菌株的发酵滤液活性物质在100℃处理60min保持较稳定状态,而在121℃高温情况下处理30min,其活性明显下降;紫外灯照射10min内其活性与对照无明显差异,而照射30min以上时其活性下降明显;在pH 2-6范围内或偏酸性条件下其活性较稳定,在pH 8-12的范围内,发酵滤液活性物质的活性呈明显下降的趋势,说明该抑菌活性物质对碱敏感,即在碱性条件下不稳定。综合评价该代谢产物稳定性良好。