食管癌是最常见的恶性肿瘤之一,我国是食管癌发病率以及死亡率最高的国家,最常见的病理类型是食管鳞状细胞癌(ESCC),每年的新发病例占全世界的50%。最近的研究表明,同一肿瘤的多个区域的DNA测序和染色体分析发现肿瘤内异质性(ITH)普遍存在于ESCC中。ITH是抗药性和治疗失败的主要原因,ESCC手术后5年生存率约30%,分析ESCC患者的基因组多样性,识别新的靶标,筛选早期诊断标记物以及设计个体化治疗策略是当今研究的热点和难点。目的:探讨食管鳞状细胞癌的肿瘤内异质性及ZNF750,EP300,MTOR,KMT2D的表达对患者预后的影响。方法:1回顾性分析2008年1月至2010年12月间在河北医科大学第四医院组织病理学诊断为食管鳞状细胞癌并随即进行手术的1782例患者,随访成功共1550例ESCC患者,失访232例,随访率为86.9%。对全部1550例患者的HE染色切片进行阅片,筛选了106例具有肿瘤内异质性的ESCC患者,每个病例HE染色切片下均有2个病灶区域有显著组织学或形态学的差异。106例患者手术前均未接受任何治疗,无其他肿瘤病史,并且都有完整的临床资料。2使用免疫组织化学(IHC)HRP法,分别检测106例患者的ZNF750,KMT2D,EP300及MTOR的蛋白表达水平及不同病灶间的表达差异。标本均经10%福尔马林固定,常规取材,石蜡包埋制片,HE染色及免疫组织化学染色,光镜观察。免疫组化判定方法为:根据所观察到的阳性染色肿瘤细胞的百分比及染色强度进行评分,高表达组为总分为4?9的标本。低表达组包括阴性表达或低表达,总分为0至3。3使用一种新颖的基于RNA原位杂交的方法(RNA scope),从106例ESCC患者中随机选取12例患者福尔马林固定石蜡包埋组织,使用特异的RNA探针分别检测ZNF750,KMT2D,EP300及MTOR的m RNA转录水平及不同病灶区域间的表达差异。在m RNA高表达的癌细胞中信号数较多(3~4分),在m RNA低表达的癌细胞中信号数较少(0~2分)。4运用统计软件SPSS21.00对所得到的数据进行统计学分析,两个独立样本比较采用卡方检验,Kaplan-Meier法进行单因素生存分析,COX回归进行多因素分析,组间比较使用Log-rank检验。以α=0.05为检验标准,P<0.05则有统计学意义。结果:1临床病理特征2008-2010年间1550例ESCC患者男性1038例,女性512例,106例具有异质性的ESCC患者,男性80例,女性26例;两组病例比较,差异无统计学意义(P=0.071)。1550例ESCC患者的发病年龄为18~81岁,中位年龄60岁,平均年龄59.93岁,肿瘤发生部位上段205例,中段1092例,下段253例,淋巴结转移率38.58%(598/1550),脉管瘤栓阳性率为25.61%(397/1550),组织学病理分级G1为121例,G2为1161例,G3为268例,临床分期Ⅰ期236例,Ⅱ期747例,Ⅲ期549例,Ⅳ期18例,肿瘤浸润深度T1为281例,T2为259例,T3为1010例,生存期为1~108个月,5年生存率为48.30%,中位生存期为57个月;106例具有异质性的ESCC患者发病年龄为39-76岁,中位年龄59岁,平均年龄为59.28岁,发病部位上段15例,中段62例,下段29例,淋巴结转移率为55.67%(59/106),脉管瘤栓阳性率为36.79%(39/106组织学病理分级G1为5例,G2为73例,G3为28例,临床分期Ⅰ期7例,Ⅱ期39例,Ⅲ期60例,浸润深度T1为9例,T2为27例,T3为70例,生存期为4~105个月,5年生存率为34.00%,中位生存期为30个月。两组病例比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。22免疫组织化学结果2.1 ZNF750蛋白的表达与临床指标及肿瘤异质性的相关性分析106例食管鳞癌组织中58例(54.72%)ZNF750高表达,48例(45.28%)低表达。ZNF750蛋白的表达与组织学分级、临床分期、浸润深度、脉管瘤栓、淋巴结转移密切相关(P均<0.05)。ZNF750表达和肿瘤发生部位、性别和年龄之间未发现显著的相关性。ZNF750低表达组较高表达组具有更差的预后(χ2=25.821,P=0.000)。本研究所筛选的106例ESCC患者中,ZNF750在44例(41.51%)患者中显示异质性表达,由于两个病灶不都高表达,ZNF750在212个病灶区域中的高表达率为33.96%(72/212),低于106例ESCC患者中的高表达率(54.72%)。2.2 EP300蛋白的表达与临床指标及肿瘤异质性的相关性分析106例食管鳞癌组织中66例(62.26%)EP300高表达,40例(37.72%)低表达。EP300蛋白表达与组织学分级、临床分期、脉管瘤栓、淋巴结转移密切相关(P均<0.05)。EP300表达和肿瘤发生部位、浸润深度、性别和年龄之间未发现显著的相关性。EP300高表达组较低表达组具有更差的预后(χ2=14.037,P=0.000)。本研究所筛选的106例ESCC患者中,EP300在37例(34.90%)患者中显示异质性表达,由于两个病灶不都高表达,EP300在212个病灶区域中的高表达率为44.81%(95/212),低于106例ESCC患者中的高表达率(62.26%)。2.3 MTOR蛋白的表达与临床指标及肿瘤异质性的相关性分析106例食管鳞癌组织中75例(70.75%)MTOR高表达,31例(29.25%)低表达。MTOR蛋白表达与组织学分级、临床分期、脉管瘤栓、淋巴结转移密切相关(P均<0.05)。MTOR高表达和肿瘤发生部位、浸润深度、性别和年龄之间未发现显著的相关性。MTOR高表达组较低表达组具有更差的预后(χ2=29.856,P=0.000)。多因素分析显示MTOR是预后的独立影响因素(χ2=12.166,P=0.000)。MTOR在39例(36.79%)患者中显示异质性表达,由于两个病灶不都高表达,MTOR在212个病灶区域中的高表达率为52.36%(111/212),低于106例ESCC患者中的高表达率(70.75%)。2.4 KMT2D蛋白的表达情况106例食管鳞癌组织中免疫组织化学检测KMT2D不表达。3 RNAScope实验结果3.1 ZNF750的mRNA表达与临床指标及肿瘤异质性的相关性分析根据RNAScope染色评分指南显示,12例食管鳞癌组织中,66.67%的ZNF750高表达:6例评分为4分,2例评分为3分;33.33%的ZNF750低表达:4例评分为1分。ZNF750高表达与组织学分级、临床分期、脉管瘤栓、淋巴结转移、年龄密切相关(P均<0.05)。ZNF750高表达和肿瘤发生部位、性别未发现显著的相关性。8例患者ZNF750 mRNA显示异质性表达,其中6例异质性表达与免疫组化一致。3.2 EP300的mRNA表达与临床指标及肿瘤异质性的相关性分析12例食管鳞癌组织中,83.33%的EP300高表达:2例评分为4分,8例评分为3分;16.67%的EP300低表达:2例评分为2分。EP300表达与组织学分级、临床分期、淋巴结转移、性别、肿瘤发生部位密切相关(P均<0.05)。EP300表达和肿瘤年龄、浸润深度、脉管瘤栓未发现显著的相关性。8例患者EP300 mRNA显示异质性表达,其中6例异质性表达与免疫组化一致。3.3 MTOR的mRNA表达与临床指标及肿瘤异质性的相关性分析12例食管鳞癌组织中,33.33%的MTOR高表达:2例评分为4分,2例评分为3分,66.67%的MTOR低表达:6例评分为2分。MTOR高表达与组织学分级、临床分期、脉管瘤栓、浸润深度、淋巴结转移、年龄密切相关(P均<0.05)。MTOR高表达和肿瘤发生部位、性别未发现显著的相关性。4例患者MTOR mRNA显示异质性表达,其中4例异质性表达与免疫组化一致。3.4 KMT2D的mRNA表达与临床指标及肿瘤异质性的相关性分析12例食管鳞癌组织中,50%的KMT2D高表达:6例评分为3分;50%的KMT2D低表达:4例评分为2分,2例评分为1分。KMT2D高表达与组织学分级、临床分期、脉管瘤栓、浸润深度、淋巴结转移、年龄、肿瘤发生部位、性别未发现显著的相关性。4例患者KMT2D m RNA显示异质性表达。结论:1具有异质性的食管鳞状细胞癌患者具有更差的生存与预后。2在食管鳞状细胞癌组织中,ZNF750、EP300及MTOR的蛋白表达与肿瘤异质性相关。3 ZNF750蛋白表达与ESCC患者的预后呈正相关,EP300、MTOR蛋白表达与ESCC患者的预后呈负相关,临床分期和MTOR蛋白的表达是ESCC患者预后的独立影响因素。4 RNAscope检测方法具有很好的稳定性与敏感性,是探索新的肿瘤标志物及检测肿瘤内异质性更可靠的检测手段。ZNF750、EP300、KMT2D以及MTOR原位m RNA检测可作为提示食管癌基因突变候选基因,具有潜在的临床应用价值。