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动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种慢性炎症性疾病,以强烈的免疫活化为特征,T细胞介导的免疫反应在疾病的发生和发展过程中发挥着重要作用。目前已明确,无论是在人体还是小鼠模型,各个发展阶段的动脉粥样硬化斑块均存在大量的T淋巴细胞,包括CD4+和CD8+ T细胞亚群。目前尚无充足的证据能完全阐明AS病理过程中的免疫调控机制。B7/CD28家族成员相关路径在调控T细胞相关的刺激性与抑制性信号的平衡方面起关键作用,从而对抗微生物感染及实现自身免疫耐受。该类路径提供第二信号调控T细胞反应的激活、抑制及微调。过去几年研究发现,B7/CD28家族有许多能削弱T细胞应答并促进T细胞耐受的抑制性信号通路,其中近年发现的程序性死亡因子-1(PD-1)及其配体(PD-L)通路由于独特的抑制功能引人瞩目,被认为是影响自身免疫和感染性疾病慢性化的重要因素。PD-1也称CD279,属于免疫球蛋白超家族成员,主要与抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APCs)表面的PD-L1和PD-L2(分别又称为B7-H1和B7-DC)结合后抑制T细胞免疫反应。干扰素α、β和γ是强有力的PD-L1表达上调因子,可促进PD-L1表达于抗原提呈细胞、内皮细胞和上皮细胞。PD-1具有整合功能,可通过与PD-L的相互作用整合DC的信号,继而控制T细胞耐受和活化。目前,PD-1/PD-L路径正逐渐成为重要的T细胞反应调控子,控制慢性感染性疾病及自身免疫疾病的过程。其中,PD-1/PD-L路径与DC-T细胞相互作用之间的关系更是受到了广泛关注。作为体内抗原提呈能力最强的APCs,DC在免疫调控方面发挥着至关重要的作用。相对于PD-L2的作用而言,DC表面的PD-L1更值得关注。最新研究发现,在PD-L1/2-/-LDLR-/-小鼠模型体内,高胆固醇血症及其导致的动脉粥样病变为系统免疫性疾病,受PD-1/PD-L1/2路径的调节。这一路径是否影响了人体内T细胞对高胆固醇血症或其他相关抗原的反应及相应的动脉病变的进展,目前尚无报道。本研究以动脉粥样硬化患者为研究对象,取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),分别检测CD4+、CD8+ T淋巴细胞与髓系树突状细胞(myeloid dendritic cells,mDCs)表面的PD-1与PD-L1的表达水平,并分析其表达水平的高低与细胞免疫活性之间的关系,如mDCs刺激T细胞增殖的能力和分泌细胞因子的能力等;干扰素体外干涉PD-L1的表达,研究其表达变化对免疫活性的影响,以期阐明PD-1/PD-L1路径对机体免疫过程的影响及其在动脉粥样硬化病变过程中所发挥的作用,从而为AS的免疫调控治疗提供新的理论依据。为此,本研究主要完成了以下三方面的工作:1标本的收集、细胞因子检测及PBMC表面PD-1/PD-L1的表达特点分析按入选标准筛选我科确诊的动脉粥样硬化病人,肝素抗凝管收集其外周血,并整理相关临床资料;分离外周血PBMC;ELISA法检测患者血清中IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-12等细胞因子的浓度;利用流式细胞仪检测入选患者外周血CD4+、CD8+ T细胞表面PD-1及PD-L1的表达水平,检测mDCs表面PD-L1的表达水平,以健康志愿者作对照。2 PD-1/PD-L1路径对动脉粥样硬化患者T淋巴细胞免疫功能的影响细胞阳性分离试剂盒分离纯化CD4+、CD8+ T细胞及mDCs,用患者及健康人的mDCs与非自体健康人的CD4+或CD8+ T细胞混合培养,以同种异体淋巴细胞增殖反应为基础,采用[3H]-TdR掺入法和ELISA法分别检测细胞的增殖和细胞培养上清中炎症相关细胞因子的浓度。3体外刺激PD-L1上调后mDCs功能改变及其对T细胞的影响α干扰素可在体外短期内上调PD-L1在mDCs表面的表达,本研究利用α干扰素作为PD-L1的正性调控因素,通过α干扰素对mDCs的作用,研究上调PD-L1表达对mDCs刺激T细胞增殖能力的影响及细胞因子分泌功能的影响。同样以异体淋巴细胞增殖反应为基础,采用[3H]-TdR掺入法和ELISA法检测细胞的增殖和细胞培养上清中炎症相关细胞因子的浓度。结果:1动脉粥样硬化患者外周血中CD4+、CD8+ T细胞表面PD-1的表达百分比下降,CD4+ T细胞、mDCs表面PD-L1的表达百分比下降。2动脉粥样硬化患者外周血中促炎细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-12)水平明显增高,而抗炎细胞因子IL-10则明显降低,且稳定性心绞痛组与急性冠脉综合征组也有明显差异(可能是急性冠脉综合征时炎症反应增强的结果)。3异体淋巴细胞增殖反应显示,患者的mDCs刺激异源性CD4+或CD8+ T细胞增殖的能力和分泌I型效应细胞因子(IFN-γ、IL-2)的能力比健康人的mDCs明显升高;细胞培养上清中IL-12的浓度明显升高,而IL-10的浓度则明显降低,说明患者mDCs与T细胞之间的相互作用能力较健康人增强。4α干扰素可以上调mDCs表面PD-L1的表达,造成mDCs刺激异体CD4+或CD8+ T细胞增殖的能力下降,促炎细胞因子分泌水平降低;同时,PD-L1表达的上调使mDCs与T细胞之间的相互作用能力下降,IL-12浓度降低,而IL-10浓度升高。结论:1程序性死亡因子1及其配体表达水平在动脉粥样硬化过程中下调,影响了淋巴细胞与mDCs之间的相互作用,使T细胞增殖能力增强,炎性细胞因子分泌水平升高,炎症过程加剧。2 PD-1/PD-L1路径可能在动脉粥样硬化发生发展过程中发挥关键作用,对其进行调控可能改变机体的免疫状态,从而控制动脉粥样硬化的发病及病理改变过程。