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研究目的胃癌是我国第二大常见肿瘤,具有恶性度高、进展快、易发生化疗耐药等特点,从而导致其临床治疗效果不佳、预后较差;因此探索在胃癌化疗耐药中发挥关键作用的分子,对于提高胃癌疗效具有重要意义。蛋白泛素化的异常与肿瘤的发生、发展密切相关,但其在肿瘤化疗耐药中的作用有待于进一步研究。Cullin 4A(CUL4A)是Cullin-RING泛素连接酶4A复合体的组成部分,在泛素连接酶(E3)中发挥支架蛋白的作用。其N端通过接头蛋白DDB1招募不同的底物受体蛋白(DCAFs)与相应的靶蛋白结合,C端则通过结合ROC1/RBX1小分子招募泛素整合酶(E2),使结合于E2上的泛素小分子与靶蛋白彼此靠近,从而介导特定靶蛋白的泛素化过程。CUL4A泛素连接酶的底物涉及广泛,在信号传导、转录调控、细胞周期调节、维持基因组稳定性以及胚胎发育等一系列生物学过程中均发挥着重要作用。我们近期的研究发现,CUL4A的表达水平与胃癌患者的化疗耐药性密切相关,CUL4A表达水平低的胃癌患者对化疗更加耐受。这一结果提示,CUL4A可能参与调控了胃癌细胞对化疗药物的敏感性。本研究旨在进一步揭示CUL4A在胃癌顺铂耐药中的作用及其分子调控机制,为胃癌化疗增敏药物的研发提供新的思路。研究方法1.通过Western Blotting检测多种胃癌细胞系及正常胃上皮细胞GES-1中CUL4A的表达水平。2.首先将实验室已构建好的CUL4A敲降型质粒及慢病毒包装质粒通过转染试剂LipofectamineTM3000转入293T细胞中,合成具有沉默CUL4A表达能力的慢病毒颗粒(p LKO-Tet-On-sh CUL4A)。随后用sh CUL4A慢病毒颗粒感染胃癌细胞株,构建CUL4A敲降的稳定胃癌细胞株模型。通过Western Blotting检测CUL4A敲降细胞中CUL4A蛋白的表达情况3.利用CCK8法检测敲低CUL4A对胃癌细胞系SNU-1、MKN45增殖活性的影响,并通过流式细胞术检测敲低CUL4A对上述胃癌细胞周期、凋亡的影响。4.利用CCK8法检测敲低CUL4A后胃癌细胞SNU-1、MKN45对顺铂敏感性的变化情况。5.通过上述2的方法构建四环素诱导型CUL4A敲降胃癌细胞SNU-1模型。加入四环素诱导敲低SNU-1中CUL4A后。收取总蛋白(对照组和敲降组蛋白),通过i TRAQ蛋白质质谱技术分析、筛选CUL4A泛素连接酶的潜在底物蛋白。6.在SNU-1及MKN45细胞中敲低CUL4A后,通过Western Blotting、q RT-PCR方法检测上述潜在底物蛋白在转录水平和蛋白水平的变化情况,筛选出蛋白水平升高,但m RNA水平没有变化的潜在底物蛋白CLIC4。7.通过Co-IP、Ubiquitin Assay、半衰期等实验进一步探讨CLIC4作为CUL4A泛素连接酶底物的可能性。8.在敲低CUL4A的基础上进一步敲低CLIC4后,利用CCK8法检测胃癌细胞SNU-1及MKN45对顺铂敏感性的变化。研究结果1.在胃癌细胞系SNU-1、SGC-7901、MGC-803、MKN45、AGS和HGC-27中,CUL4A均有较高的表达水平。2.在胃癌细胞系SNU-1、MKN45中敲低CUL4A对细胞的增殖、周期、凋亡无明显影响,但能够明显增强细胞对顺铂的耐受性。3.在胃癌细胞中筛选、鉴定出了一个新的CUL4A泛素连接酶底物蛋白CLIC4。4.在CUL4A敲降胃癌细胞中进一步敲低CLIC4后,胃癌细胞对顺铂耐受性有所减弱。结论1.在胃癌细胞中敲低CUL4A的表达水平能够明显增强细胞对顺铂的耐药性,说明CUL4A在胃癌化疗耐药机制中具有重要作用。2.在胃癌细胞中,CUL4A能够通过介导CLIC4蛋白的泛素化调控其蛋白水平,从而改变胃癌细胞对顺铂的耐受性。