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低密度脂蛋白受体相关蛋白4(Low-density lipoprotein receptor-related protein4，LRP4)抗体是一种新近发现的介导重症肌无力(myasthenia gravis，MG)发病的分子。而MG是一种已被许多学者公认的由自身抗体介导的免疫性疾病，由神经肌肉接头(neuromuscular junction，NMJ)的突触传递受损所致。80％的MG患者可检测到抗肌肉烟碱型乙酰胆碱受体(Acetylcholine receptor，AChR)AChR的自身抗体，约20％的MG患者是乙酰胆碱受体抗体阴性。最近，在2-27％没有AChR和MuSK抗体的患者中发现了LRP4的自身抗体，并且动物模型提示这些抗体的致病作用。目前关于MG终板膜的修复机制研究报道较为少见。而实验性自身免疫性重症肌无力动物模型(Experimental autoimmune myastheia gravis，EAMG)是研究MG的一种可靠的动物模型，是用于研究疾病机制和/或治疗该疾病的方法的重要工具，与人类中MG具有许多相似的免疫病理学和临床特征，包括血清中抗AChR抗体的存在，NMJ上IgG和补体的沉积，以及肌肉AChRs的丧失。目前常用人工合成鼠源的AChR-α亚单位97-116多段(R97-116)制备EAMG模型。 最近，SNX17已被鉴定为低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein，LDL)受体家族的几个成员的结合配偶体，且在预防含有NPxY基序的β1整联蛋白、低密度脂蛋白受体和P-选择蛋白溶酶体降解中起重要作用。本课题组前期发现MG患者肋间肌肌细胞中分拣微管连接蛋白17(Sorting nexin17，SNX17)含量明显增高，并与AChR共定位于NMJ处，通过双向免疫共沉淀(Co-IP)及蛋白印迹(Western Blotting，WB)实验验证了原核表达的LRP4胞内区蛋白与真核表达的SNX17体外可发生直接结合，推测LRP4在MG患者NMJ处肌细胞内通过与SNX17结合，逃避了溶酶体的降解途径，直接插入细胞膜再循环利用，修复NMJ终板膜LRP4-MuSK-nAChR功能单元。为了了解肌细胞SNX17、LRP4的表达特点，本实验分别从细胞水平和动物水平运用WB、实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)技术进行分析。 目的： 利用诱导C2C12细胞分化并给予处理及采用人工合成鼠源性AChR-α亚单位97～116肽段建立EAMG大鼠模型，运用WB、qRT-PCR技术分析SNX17、LRP4在不同骨骼肌细胞中的表达特点。 方法： 1.原代C2C12细胞的分化及处理:从SD大鼠胎鼠（1-2天）提取C2C12成肌原代细胞，并用2％马血清诱导分化，然后分为空白对照组及实验处理组，分别给予加入AChR抗体阳性的MG患者血清处理(AChRAb组)及加入兔抗鼠的LRP4抗体(1∶1000)处理（LRP4Ab组），并分别收集0h、0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h时的处理细胞。 2.EAMG实验大鼠模型的建立:采取主动免疫法。将20只健康雌性LEWIS大鼠(6-8周，体重150-160g)，按照随机数字法随机分为两组，对照组10只，实验组10只。采用鼠源性AChR-α亚单位97～116肽段为免疫原诱导模型组LEWIS大鼠建立实验动物模型。正常对照组给予注射相同剂量的佐剂与PBS。初次免疫第30天及第45天分别于同等部位给予同等剂量免疫。第三次免疫一周后开始评价模型。以Lennon分级评分≥1分，ELISA法测定AChR-Ab呈阳性，同时低频(5Hz)重复电刺激后，腓肠肌肌电图在第5次出现衰减幅度大于10％为EAMG大鼠模型造模成功标准。 3.qRT-PCR法检测肌细胞SNX17、nAChRβ1亚基、LRP4、MuSK分子mRNA含量:5％水合氯醛麻醉大鼠，取出眼肌、咀嚼肌、腓肠肌肌肉组织，预冷PBS洗涤2次，每组肌群各称取40mg肌肉液氮下匀浆，用Trizol一步法提取RNA，并按照反转录试剂盒说明书将RNA反转成cDNA。Premier5.0设计引物，SNX17上游引物序列GACGACGATGTCATGGAGAA，下游引物序AGATTTGAGCTGTCGGTGCT，扩增产物长度117bp;nAChRβ1亚单位其上游引物为AGCCTGAACGAGAAGGATGA，下游引物为TGACACGGAGAGACTCGATG，扩增产物长度119bp;LRP4上游引物序列:GATGGTTCCTGTCGCAAAGT，下游引物序列，CGTTCAATCTTGGCAATGTG,扩增产物长度122bp;MuSK上游引物序列ACCCCAACATTGTGAAGCTC，下游引物序列AGTGTGAGGGGACATGCTTC，扩增产物长度119bp;β-actin作为内参，其上游引物序列为TGTCACCAACTGGGACGATA，下游引物序列为GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA，扩增产物长度165bp，均由上海生工合成。qPCR法采用20ul反应体系，荧光预变性反应条件为95℃30S;PCR的反应条件为95℃5S、55℃30S，45个循环。采用相对表达量2-△△ct的方法算出各个目的基因的相对表达量。 4.WB法检测肌细胞SNX17、LRP4、EEA1蛋白含量:取出上述各肌肉组织，加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解30min，在超低温离心机以12000rpm的速度离心5min，然后取上清，采用BCA法进行检测细胞蛋白的浓度，每个孔加入6ul样品，GAPDH作为内参，小鼠抗大鼠SNX17抗体(1∶500)、小鼠抗大鼠LRP4抗体(1∶1000)、兔抗大鼠EEA1(1∶1000)及兔抗鼠GAPDH抗体(1∶1000)一抗孵育4℃过夜，第二天37℃复温0.5h，HRP标记的羊抗小鼠抗体(1∶10000)和HRP标记的羊抗兔抗体(1∶10000)37℃孵育1h，然后曝光，采用图像分析软件Quantity One分别进行测定目的基因和GAPDH的显色条带平均值，各组蛋白表达强度为二者平均值的比值。 结果： 1.细胞水平:成功诱导分化C2C12肌管细胞，与空白对照组相比，AChRAb组SNX17、LRP4基因表达含量均上调，差异显著均有统计学意义(p＜0.05)，且随时间的增加表达增强，1.5小时之后组间比较无统计学意义(p＞0.05);LRP4Ab组SNX17基因表达含量降低，而LRP4基因表达含量升高，差异均有统计学意义(p＜0.05）。 2.动物水平:按照EAMG大鼠模型成功造模标准，本次实验共纳入8只EAMG模型大鼠。基因检测结果显示，EAMG大鼠眼肌MuSK和nAChRβ1亚单位基因表达较正常组显著下降(p＜0.05)，而咀嚼肌和腓肠肌中两者变化不大;LRP4、SNX17在三组肌群均无明显改变。WB结果显示，EAMG大鼠眼肌LRP4蛋白显著降低(p＜0.01)，而EEA1蛋白表达增加(p＜0.05)，但该蛋白在腓肠肌中表达下降(P＜0.01);腓肠肌SNX17蛋白含量增加显著(p＜0.01)。 结论： 1.使用不同的MG自身抗体刺激，SNX17、LRP4在细胞水平呈现不同变化的特点，说明LRP4Ab和AChRAb引起的肌细胞反应是不一样的，LRP4Ab组SNX17、LRP4基因表达均增加，而AChRAb组SNX17基因表达含量降低，LRP4基因表达含量增加; 2.动物水平AChRAb引起的眼肌、咀嚼肌和腓肠肌肌细胞SNX17、LRP4等终板膜相关蛋白变化不同，其中眼肌LRP4、MuSK和nAChRβ1亚单位表达均明显降低，SNX17蛋白在腓肠肌中表达显著增加，可部分解释AChRAb介导的重症肌无力易累及眼肌的原因。