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伯基特淋巴瘤(Burkitt Lymphoma)是由Donnis Burkitt于1958年首先报道一种高度侵袭、来源于生化中心的B细胞淋巴瘤。短周期、大剂量的化疗可使大部分儿科患者获得治愈,但因化疗药物并发症及耐药性,成年及晚期患者化疗效果往往欠佳,故有必要寻找低毒、有效的治疗方法。目前已有报道认为PI3K/AKT/mTOR信号通道异常激活参与伯基特淋巴瘤发病机制,故课题拟从抑制PI3K/AKT/mTOR信号通道进行研究,以寻找伯基特淋巴瘤的靶向治疗目标,本研究共分为以下五部分:第一部分PI3K/AKT/mTOR信号通道在伯基特淋巴瘤中的活化目的:了解PI3K/AKT/mTOR信号通道在伯基特淋巴瘤细胞中的活化情况方法:1、对伯基特淋巴瘤、反应性淋巴结增生病理蜡块进行免疫组化,分析p-AKT、p-mTOR、p-RPS6水平差别;2、对RAJI细胞、CA46细胞、伯基特淋巴瘤新鲜组织块、急性淋巴细胞白血病(L3)细胞、正常健康志愿者单个核细胞进行Western Blot分析p-AKT、p-mTOR水平差别。3、对RAJI细胞、CA46细胞、伯基特淋巴瘤新鲜组织块、急性淋巴细胞白血病(L3)细胞、正常健康志愿者单个核细胞进行RT-PCR分析PI3K、mTOR、AKT的mRNA表达。结果:1、伯基特淋巴瘤病理蜡块p-AKT、p-mTOR、p-RPS6的蛋白水平高于反应性淋巴结增生;2、RAJI、CA46细胞、伯基特淋巴瘤新鲜组织块、急性淋巴细胞白血病(L3)细胞p-AKT、p-mTOR蛋白水平高于正常志愿者;3、RAJI细胞、CA46细胞、伯基特淋巴瘤新鲜组织块、急性淋巴细胞白血病(L3)细胞、健康志愿者单个核细胞PI3K、mTOR、AKT的mRNA表达无明显差别。结论:1、PI3K/AKT/mTOR信号通道在伯基特淋巴瘤细胞中异常激活;2、伯基特淋巴瘤细胞PI3K、AKT、mTOR基因转录水平正常。第二部分nvp-bez235对伯基特淋巴瘤细胞增殖作用的研究目的:研究nvp-bez235对伯基特淋巴瘤细胞的作用机制方法:mtt法检测抑制率,流式细胞术检测细胞周期、凋亡变化,westernblot检测细胞p-akt(thr308)、p-akt((ser473)、p-rps6蛋白水平的差别。结果:1、nvp-bez235可抑制伯基特淋巴瘤细胞增殖,具有浓度依赖性和时间依赖性;2、nvp-bez235可引起伯基特淋巴瘤细胞g1/g0细胞周期比例增加,具有浓度依赖性;3、nvp-bez235可引起伯基特淋巴瘤细胞凋亡细胞比例增加;4、nvp-bez235可引起伯基特淋巴瘤细胞p-akt(thr308)、p-akt((ser473)、p-rps6表达减少。结论:nvp-bez235通过抑制pi3k/akt/mtor信号通道,可引起细胞周期阻滞及促进细胞凋亡而抑制伯基特淋巴瘤细胞增殖。第三部分抑癌基因pten真核表达载体的构建及对伯基特淋巴瘤细胞增殖影响的研究目的:构建pcdna3.1-pten真核表达载体;研究外源性pten基因表达对伯基特淋巴瘤细胞ca46增殖作用的影响。方法:酶切法、基因测序鉴定pten序列,脂质体法转染细胞,rt-pcr、westernblot检测pten基因的表达,mtt检测抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡变化,westernblot检测细胞p-akt的表达。结果:1、成功构建出pcdna3.1-pten真核表达载体;2、转染pcdna3.1-pten可使伯基特淋巴瘤细胞ca46细胞增殖受抑制,并与nvp-bez235具有协同作用;3、pcdna3.1-pten可促进伯基特淋巴瘤细胞凋亡,并与nvp-bez235具有协同作用;4、pcdna3.1-pten可持续引起伯基特淋巴瘤细胞p-akt(thr308)蛋白水平降低。结论:加强外源性pten表达可持续抑制伯基特淋巴瘤细胞akt(thr308)磷酸化,阻滞pi3k/akt/mtor信号通道,诱导细胞凋亡,抑制伯基特淋巴瘤细胞ca46增殖,并与nvp-bez235具有协同作用。第四部分nvp-bez235逆转伯基特淋巴瘤raji细胞阿霉素耐药的研究目的:研究nvp-bez23对耐阿霉素细胞株raji/dox的逆转耐药作用。方法:利用浓度梯度法诱导耐阿霉素细胞株raji/dox;westernblot测定pgp、p-akt、p-mtor蛋白水平;mtt法测定细胞抑制率、spss测定ic50。结果:1、成功诱导出耐阿霉素细胞株RAJI/DOX;2、耐阿霉素细胞株RAJI/DOX的p-AKT、p-mTOR蛋白水平高于亲本细胞RAJI;3、NVP-BEZ235可引起耐阿霉素细胞株RAJI/DOX的p-AKT、p-mTOR蛋白水平下降;4、NVP-BEZ235能够抑制耐阿霉素细胞株RAJI/DOX增殖,与阿霉素具有协同作用。结论:PI3K/AKT/mTOR通道在耐阿霉素伯基特淋巴瘤细胞进一步活化;NVP-BEZ235通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通道活化,能够与阿霉素协同抑制伯基特淋巴瘤耐药细胞,逆转伯基特淋巴瘤耐药细胞对阿霉素的耐药性。第五部分NVP-BEZ235对RAJI祼鼠移植瘤的作用研究目的:研究NVP-BEZ235对RAJI祼鼠移植瘤的作用方法:将带有RAJI细胞移植瘤祼鼠分为实验组与对照组;定期监测测量肿块大小以判断肿瘤增长速度;免疫组化分析p-AKT、p-mTOR、p-RPS6水平;ELASA测定尾静脉血中VEGF的水平。结果:1、NVP-BEZ235能够抑制移植瘤增长;2、NVP-BEZ235能够降低移植瘤VEGF分泌;3、NVP-BEZ235能够抑制移植瘤AKT、mTOR、RPS6的磷酸化。结论:NVP-BEZ235可抑制伯基特淋巴瘤移植瘤PI3K/AKT/mTOR信号通道,抑制肿瘤生长,降低VEGF分泌。通过以上研究,我们发现PI3K/AKT/mTOR信号通道在伯基特淋巴瘤异常激活,抑制PI3K/AKT/mTOR信号通道活化可抑制体内、体外肿瘤生长并能逆转肿瘤化疗耐药,故PI3K/AKT/mTOR信号通道可作为伯基特淋巴瘤靶向治疗的研究目标。