论文部分内容阅读
研究目的：CD147是一种属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白,本实验组前期研究表明CD147能促进恶性黑素瘤侵袭、转移、增殖和血管新生,但具体机制还不十分清楚。钙离子信号调节亲环素配体(calcium-modulating cyclophilin ligand, CAML)是定位于线粒体的跨膜蛋白,能调节胞内钙离子浓度,本研究拟通过对CD147与CAML在恶性黑素瘤细胞株A375中相互作用的研究,明确其相互作用的位点,在细胞中的定位及对胞内钙离子的影响,为进一步揭示恶性黑素瘤发生发展的分子机制提供理论依据。研究方法：1.以CD147为诱饵,运用酵母双杂交技术筛选人胚脑细胞文库,以寻求与其相互作用的蛋白。2.构建CAML与CD147全长及缺失突变体的真核表达载体。3.运用免疫共沉淀(co-IP)验证CD147与CAML相互结合,同时共转染CAML质粒及CD147的不同缺失突变体质粒至工具细胞293T, co-IP分析CD147与CAML相互结合的位点。4.运用细胞免疫荧光方法观察A375细胞中CD147与CAML的定位,同时在A375细胞中共转染CAML及CD147的不同缺失突变体质粒,检测不同区段对定位的影响。5.合成CD147的小分子干扰RNA(small interfering RNA, iRNA)片段,利用该片段在A375细胞中敲降CD147并检测敲降效率。6.运用Fluo-4, AM探针观察CD147敲降对A375细胞内静息钙离子浓度的影响,以及毒胡萝卜素(thapsigargin, TG)抑制内质网钙离子ATP酶(Sarco/Endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA)后对胞内钙离子流动的影响。7.运用佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate, PMA)和TG上升A375细胞胞内钙离子,检测基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9, MMP-9)的表达水平,同时检测CD147敲降的A375细胞在上述两种药物作用后的MMP-9表达水平的变化。研究结果：1.酵母双杂交筛选出CAML与CD147相互作用。2.成功构建了CAML与CD147全长及缺失突变体的真核表达载体。3. Co-IP验证CAML与CD147相互作用的结果,并进一步证实CD147与CAML相互结合的区段位于CD147跨膜段。4.细胞免疫荧光发现A375细胞中CD147与CAML在内质网存在共定位现象,缺失跨膜及膜内段的CD147突变体与CAML几乎不存在共定位。5.成功设计并应用两个CD147siRNA片段,以无特异性siRNA序列为对照组。6.CD147敲降的A375细胞内静息钙离子浓度及TG刺激胞浆内钙离子上升幅度均低于对照组。7.PMA及TG上升胞内钙离子后能诱导MMP-9的表达增加,而敲降CD147则能显著抑制钙离子对MMP-9的诱导效应。结论1.CD147与CAML相互结合,结合域位于CD147跨膜段；2.恶性黑素瘤细胞中CD147与CAML在内质网中存在共定位现象,CD147跨膜段及膜内段共同影响其定位；3.CD147对A375细胞胞浆钙离子具有正调节作用；4.上升A375细胞胞内钙离子能诱导MMP的产生增加,并且该效应可能需要通过CD147的信号转导才能实现。图4幅,表1个,参考文献39篇