植物源草酸氧化酶筛选、性质及初步纯化

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草酸氧化酶(Oxalate oxidase,OXO,EC 1.2.3.4)能够专一性地催化草酸降解为H2O2和CO2,在草酸积累相关疾病的诊断、体内草酸的清除等方面具有很大的应用潜力。为扩大OXO酶源及研究酶的性质以探讨酶的应用,本试验以45科88种植物叶片为材料,对材料在两个不同时期的OXO活性进行比较,发现OXO在不同科属的植物中广泛存在,不同植物间其活性表达存在着较大的差异;在同种植物中,不同季节和不同的生长发育时期OXO的活性表达也有明显的差异性。对其中10种植物的OXO性质进行研究发现,红丝线中OXO的最适温度为55℃,最适pH为3.0,在30~60℃、pH 2.0~4.0范围内活性相对稳定;南板蓝中OXO的最适温度为50℃,最适pH为3.5,在30~60℃、pH 2.0~2.5范围内活性相对稳定;紫金牛中OXO的最适温度为45℃,最适pH为3.0,在45~60℃、pH 2.0~2.5范围内活性相对稳定;大叶落地生根中OXO的最适温度为45℃,最适pH为3.5,在30~45℃、pH 2.0~2.5范围内活性相对稳定;柳叶白前中OXO的最适温度为50℃,最适pH为3.5,在40~65℃、pH 2.0~2.5范围内活性相对稳定;草珊瑚中OXO的最适温度为45℃,最适pH为3.0,在30~80℃、pH 2.0~2.5范围内活性相对稳定;白鹤灵芝中OXO的最适温度为35℃,最适pH为3.0,在30~55℃、pH 2.5~3.0范围内活性相对稳定;甘草中OXO的最适温度为35℃,最适pH为3.0,在30~65℃、pH 2.0~4.0范围内活性相对稳定;白花败酱中OXO的最适温度为35℃,最适pH为4.0,在45~60℃、pH 3.5~4.5范围内活性相对稳定;松果菊中OXO的最适温度为40℃,最适pH为3.0,在30~80℃、pH 2.0~3.0范围内活性相对稳定。各种材料中OXO经80℃保温处理10min后,均能保持各自最高活性的27%以上。除草珊瑚外的九种材料中OXO的活性均没有受到10mmol/L的CI的明显抑制。除南板蓝、柳叶白前、草珊瑚和甘草外,紫金牛、大叶落地生根、红丝线、白鹤灵芝、白花败酱和松果菊中的OXO活性不因胃蛋白酶的作用而受到抑制。紫金牛、草珊瑚和白鹤灵芝中OXO的活性因受到SDS的作用而发生显著的降低,红丝线、南板蓝、大叶落地生根、柳叶白前、甘草、白花败酱和松果菊中OXO的活性不受SDS的影响。OXO初步纯化的结果表明:通过简单的硫酸铵盐析和热处理可以将红丝线和草珊瑚中OXO分别纯化2.29和5.59倍,但Sephacryl S-200 Highresolution层析柱和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换与凝胶柱对红丝线中OXO纯化没有明显效果;DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换与凝胶柱对草珊瑚中OXO纯化没有明显效果;以松果菊为材料,经热处理、硫酸铵盐析和DEAE Sepharose Fast Flow柱层析三步纯化得到纯化倍数为12.32、最终活性为0.764U/mg protein的OXO。
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