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由于过渡开发利用,养殖环境恶化,再加之长期近亲繁育致使我国扇贝野生种群数量下降,养殖扇贝的遗传多样性以及抗逆性等方面呈现卜降趋势。雌雄发育不同步和繁殖时间的差异给苗种生产以及育种研究带来了许多困难。精子冷的保存技术可很好地解决上述问题。
本研究以虾夷扇贝和栉孔扇贝为研究对象,对扇贝精子的超低温冷冻和低温保存以及冷冻损伤进行了研究。以精子活力和受精率为参数,就收集精子的方法、抗冻剂的种类和浓度、冷冻程序和平衡时间对虾夷扇贝精子超低温保存效果的影响进行了研究,并进行了冻存精子与栉孔扇贝卵子的杂交实验。结果表明,肾管处收集到的精液与海水配的16%DMSO 1:3(v/v)混合,在4℃冰箱内平衡5至10min,在液氮面上方20cm、3cm分别停留3min、10min后浸入液氮保存,冻精活力在40%以上。在液氮中保存1d、8d、30d、90d后解冻,冷冻精子活力没有显著差异(p>0.05),但明显低于鲜精的精子活力。虾夷扇贝的冻精可以使栉孔扇贝卵子受精,受精率在20%以上,并能得到正常的D型幼虫。应用透射电镜和扫描电镜技术,研究了超低温冷冻保存前后虾夷扇贝精子超微结构和形态的变化。结果显示,虾夷扇贝精子由头部、中段和尾部三部分组成,外被光滑质膜:顶体位于头部最前端,呈倒"v"形,细胞核近似圆柱状,电子密度较高;4个线粒体和2个相互垂直的中心粒构成了精子的中段;鞭毛细长,轴丝为典型的"9+2"结构。经超低温冷冻保存后,冷冻损伤的精子表现为:精子被膜肿胀、被膜与核膜分离、丢失;顶体破裂、内容物流出;线粒体解体、线粒体嵴变形:鞭毛被膜肿胀、部分精子鞭毛脱落。可以推测,超低温冷冻保存对精子膜、顶体、线粒体和鞭毛的损伤导致了冻精活力和受精能力的下降。性腺内的精子处于静止状态,接触海水后大约3min才被激活,性腺组织在4℃内保存20h后仍具有60%的精子活力。精子适宜的盐度范围为26.1-32‰;适宜的pH值范围为7.0-8.5。4℃相对于14℃和-18℃更能延长精子的寿命,在海水稀释组、未稀释组和抗冻剂组中,未稀释的精液保存效果最好:保存70h后精子活力仍在40%左右。以低温保存虾夷扇贝就精与栉孔扇贝卵子进行杂交试验,结果表明,4℃下保存3d内的精子的授精率与鲜精的自交和杂交相比没有显著差异。杂交子代在实验室条件下可发育至D形幼虫。