论文部分内容阅读
当归为伞形科植物Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根,其性温,味甘,具有补血、活血、润肠、止痛等功效。当归的主要化学成分包括阿魏酸（Ferulic acid,FA）、藁本内酯（Ligustilide,LIG）与多糖等有效成分,根据2020版《中华人民共和国兽药典》规定药用当归中FA含量不得低于0.05%,挥发油含量不得低于0.4%。而LIG为当归挥发油中主要成分之一,因此测定FA与LIG含量,对控制当归质量并明确当归发挥作用的药效基础具有重要意义。但由于FA与LIG稳定性较差且极性差异大,所以目前同时提取这两种成分的方法较少。另外,目前当归中有效成分提取主要针对单一成分或大类成分如FA、LIG、酚酸类、苯酞类、多糖类,且多数提取方法需要使用有机溶剂,对环境产生一定影响,因此建立一种新型可持续性提取方法具有重要意义。联合国在《2030年可持续发展议程》中提出要合理利用能源和资源。因此,在提取中药有效成分时,尽量减少或避免有机溶剂使用,同时提高提取效率尤为重要。目前绿色可持续性的提取方法主要包括酶辅助提取法、超声辅助提取法、绿色溶剂辅助提取法、双水相辅助提取法等。这些新型提取方法具有低耗能、低耗时、环境污染小等优势。本研究将酶辅助提取法与超声辅助水相提取法相结合,即酶超声辅助双水相提取法（Enzyme and ultrasonic assisted aqueous two-phase extraction,EUA-ATPE）,用于同时提取当归中FA与LIG。本研究首先通过单因素实验优化酶的种类、比例、提取温度、p H、超声时间等提取条件。然后在单因素实验基础上利用中心复合设计（Central composite design,CCD）得到最佳提取条件。在最佳工艺条件下,比较不同提取方法的最高的综合评值（Comprehensive evaluation value,CEV）,最终确定EUA-ATPE法提取效果最佳。最后本研究对当归EUA-ATPE提取物进行体外抗氧化、抗炎活性的药效学研究。具体研究结果如下:（1）建立高效液相色谱法,检测当归提取物中FA与LIG含量。并使用熵权法计算得出FA及LIG的权重,最后通过综合评分法评价不同提取条件下当归提取物的CEV。结果表明:检测方法的专属性、线性、稳定性、回收率、精密度、重复性良好,FA与LIG权重分别为0.494与0.506。（2）通过单因素试验考察了p H、提取温度、超声时间、液料比、（NH4）2SO4质量分数、乙醇质量分数、酶的种类及比例、超声功率、总提取时间等对当归中FA、LIG提取率的影响,并通过CEV进行评价。结果表明:在单因素筛选时,p H为4.5、提取温为35℃、超声时间为30 min、液料比为35:1 m L/g、（NH4）2SO4质量分数18%、乙醇质量分数25%、超声功率为700 W、总提取时间90 min、酶的组成为Cel 160 U/g、Hem 280 U/g时当归提取物的CEV最高。（3）利用CCD法对单因素中的p H、提取温度、超声时间、液料比进行评估,以CEV为响应值,优化后结果为p H等于4.4,提取温度为33℃、液料比为35 m L/g,超声时间为25 min,CEV的预测值是4.83。同时对最佳条件进行验证,表明此结果可靠。（4）利用ELISA方法、实时荧光定量PCR法与显微镜观察,分别测定不同提取物对RAW264.7细胞中i ROS、NO、PGE2、TNF-α、IL-6、IL-1β含量及i NOS、COX-2、TNF-α、IL-6和IL-1βm RNA表达的影响及对细胞形态的恢复作用。结果表明:相比于索氏提取物处理组,EUA-ATPE提取物对细胞中炎性介质、炎性因子分泌及相应m RNA转录水平具有更显著的抑制作用,且恢复细胞形态效果更显著。另外,通过测定ABTS清除率、FRAP值来评估不同提取物的抗氧化能力。结果表明:EUA-ATPE提取物处理组与索氏提取物处理组相比,表现出更强的抗氧化能力。综上所述,EUA-ATPE提取方法可同时提取当归中FA与LIG,其具有提取率高、环境友好等优点;同时本研究利用脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症模型评估当归EUA-ATPE提取物的抗炎作用。本研究为新型提取方法的开发与应用提供了新的思路。