特异性清除β2-微球蛋白的血液灌流用吸附剂制备及性能研究

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肾脏能够清除体内代谢产物、有毒物质等,是人体重要的排泄器官。肾脏功能一旦受损,会逐步发展成为慢性肾功能衰竭(Chronic renal failure,CRF)。治疗肾功能衰竭最有效的方法是透析,但是长期透析容易引起β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)在体内某些部位沉积,造成其含量增高,长此以往会产生透析相关性淀粉样病变(Dialysis related amyloidosis,DRA),它是肾脏损伤的一种并发症。利用一种高效的方式清除体内累积的β2-MG是目前公认的治疗DRA最有效的方法。通过血液净化治疗可以降低患者体内β2-MG的水平,但目前国产的临床应用于血液净化的血液灌流用吸附材料对β2-MG没有特异性的清除作用。本论文以氯甲基化的聚苯乙烯微球(氯球,CMCPS)作为吸附载体,在CMCPS上接枝新型配基环肽,合成一种能够高效且特异性吸附β2-MG的新型吸附材料。在本论文中,我们首先利用大肠杆菌原核表达系统表达出重组β2-MG,采用Ni2+柱亲和层析、凝胶过滤层析的方法进行了纯化,并通过Western Blot、蛋白结晶方法进行验证。之后以CMCPS为吸附载体,通过亲核取代方式接枝环肽,成功制备出了特异性吸附β2-MG的新型吸附剂,通过红外光谱分析了新型吸附剂的结构,检测结果表明氯球成功接枝了环肽,之后进一步研究了它的体外吸附性能。实验结果表明,CMCPS对β2-MG的吸附量为2.717±0.005 mg/mL,吸附率为50.306±0.856%,而接枝了环肽的CMCPS对β2-MG的吸附量则达到4.986±0.009 mg/mL,吸附率为92.252±0.448%,与CMCPS相比,对β2-MG的吸附能力提高了83.3%;CMCPS对血浆中白蛋白的吸附率为20.074±0.809%,CMCPS-环肽对血浆中白蛋白的吸附率为8.591±0.650%,对血浆中白蛋白的吸附能力降低了57.2%;CMCPS对血浆中的总蛋白的吸附率为18.255±3.364%,CMCPS-环肽对血浆中的总蛋白的吸附率为20.081±5.336%,均在临床允许范围内;因此,该新型吸附剂既提高了对β2-MG的吸附能力,也降低了对血浆中白蛋白的影响并且对总蛋白的影响在临床允许范围内。此外,我们进一步通过对主要组织相容性复合物I类分子(MHCI)晶体结构的解析,截取出一段能与β2-MG在结构上特异性结合的RGVCTER蛋白,利用基因工程技术成功构建pET32a-RGVCTER蛋白重组质粒,利用大肠杆菌原核表达系统表达出重组RGVCTER蛋白,再通过多种手段纯化出RGVCTER蛋白,后期研究其与β2-MG的相互作用,与氯球接枝后有望成为另一种新型吸附剂。本论文利用分子对接软件,基于热点理论(Hot spot theory),根据β2-MG的结构设计环肽,环肽通过等温滴定量热技术证明与β2-MG具有相互作用,之后将环肽作为配基,接枝到CMCPS上,制备出一种新型吸附剂,该吸附剂对β2-MG有特异性的吸附,在血液灌流领域具有良好的应用前景。
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