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背景:脓毒症在临床上的致死率极高,多由细菌感染引起。当内毒素脂多糖释放入血液,激活炎症反应,再通过MAPK和NF-κB途径逐级扩大,最后产生瀑布效应,从而引起组织器官功能的损害。关于脓毒症目前在临床上仍缺乏有效的治疗方法。基于对脓毒症发病机制的理解,我们试图从炎症反应方面寻找治疗脓毒症的新靶点。泛素蛋白酶体系统能调节蛋白降解,影响细胞内各种活动。泛素羟基末端水解酶L1(ubiquitin C-terminal hydrolase-L1,UCH-L1)作为去泛素蛋白酶体家族中的成员存在于人类许多组织结构中,包括神经细胞,内皮细胞,平滑肌细胞等。目前许多研究证实了UCH-L1的异常表达与某些疾病有着内在联系,诸如神经疾病、局部缺血、颅脑创伤、癌症及帕金森等。UCH-L1也被证实在肾炎、血管内皮细胞炎症方面发挥一定调节作用,但UCH-L1与脓毒症炎症反应之间的关系尚未明确,有待我们进一步研究。目的:本研究通过LPS诱导人急性单核细胞白血病细胞株(THP-1)构建脓毒症体外细胞炎症模型,探讨UCH-L1与LPS诱导THP-1细胞炎症反应之间的关系及其可能的机制。内容与方法:1.利用UCH-L1的阻滞剂LDN57444抑制THP-1细胞的活性,采用ELISA法检测LDN57444(10、20、30μM)对LPS(100ng/m L)刺激THP-1细胞6、12、24小时后,其释放炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响。同时,利用MTS法检测LDN57444(10、20、30μM)对LPS(100ng/m L)刺激THP-1细胞6、12、24小时后细胞活力的影响。用Western blot法检测不同浓度LPS(0-200ng/m L)刺激THP-1后UCH-L1的表达。2.用Western blot法研究LDN57444(20μM)对LPS(100ng/m L)刺激THP-1细胞后MAPK通路中蛋白p-ERK、p-P38、p-JNK、ERK、P38、JNK的表达影响。用Western blot法探索NF-κB通路中胞核p65、胞浆p65、IκBα的表达影响。用免疫荧光共聚焦显微镜分析LDN57444(20μM)对LPS(100ng/m L)刺激THP-1细胞12小时后胞核、胞浆P65的表达。3.转染UCH-L1 si RNA(40n M)进入THP-1细胞48小时后,采用Western blot法检测UCH-L1的表达。转染si RNA后,再用LPS(100ng/m L)培养12小时后提取上清,利用ELISA法检测炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。用MTS法检测UCH-L1 si RNA对THP-1细胞活力的影响。4.采用Western blot法测UCH-L1 si RNA(40n M)对LPS诱导的THP-1中的MAPK通路中p-ERK、p-P38、P38、p-JNK、ERK、JNK的表达及NF-κB通路中胞核p65、胞浆p65、IκBα的表达。结果:1.诱导THP-1细胞的LPS浓度增加时,UCH-L1的表达上调。与LPS组相比,LDN57444+LPS组中THP-1细胞释放的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6减少(p<0.05)。LDN57444对细胞活力无明显影响(p>0.05)。2.与LPS组相比,LDN57444+LPS组中THP-1细胞p-ERK、p-P38、p-JNK的表达稍减少,P38的表达上调(p<0.05),ERK、JNK的表达无明显变化(p>0.05)。Western blot中:与LPS组相比,LDN57444+LPS组中的胞核p65减少(p<0.05),胞浆p65无明显变化(p<0.05),IκBα在15、30分钟增加(p<0.05)。共聚焦显微镜下:与LPS组相比,LDN57444+LPS组中的胞核p65有减少。3.与negative si RNA+LPS组相比,UCH-L1 si RNA+LPS组中释放炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6减少(p<0.05)。UCH-L1 si RNA对THP-1细胞活力无明显影响(p>0.05)。4.与negative si RNA组相比,UCH-L1 si RNA组中UCH-L1的表达明显减少(p<0.05)。UCH-L1 si RNA组MAPK通路中p-ERK、p-P38、p-JNK的表达稍减少(p<0.05),NF-κB通路中胞核p65的表达明显减少(p<0.05),IκBα的表达增加(p<0.05),ERK、P38、JNK、胞浆p65的表达无明显变化(p>0.05)。结论:UCH-L1促进LPS诱导的THP-1细胞炎症反应,其机制与MAPK通路蛋白及P65核转位有关。背景:脓毒症是宿主对炎症反应失控引起的多器官功能障碍。脓毒症的全球发病人数、患病率、致死率都呈逐年上升的趋势,是目前ICU中致死率最高的疾病之一。其发生机制仍未完全阐明,但始终认为炎症反应的失控是其基本机制。炎症反应是通过炎症通路逐级扩大的过程,最后促使巨噬细胞释放出大量的炎症因子,包括TNF-α、IL-1β、IL-6、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)等。这些炎症因子增加血管内皮细胞通透性,进一步加大炎症因子的释放,最终使内皮细胞损伤、缺氧、组织坏死。当LPS刺激炎症细胞后,激活了MAPK和NF-κB通路,促使许多炎症介质基因的合成及相应的炎症介质的释放。高良姜素(galangin)作为黄酮醇类化合物的一种,在缺血性损伤,抗病毒,抗肿瘤,镇痛,抗氧化,抗炎等方面都有大量的研究。我们的前期研究表明高良姜素对脂多糖(LPS)诱导的THP-1细胞炎症反应具有一定的保护作用,但高良姜素对LPS刺激巨噬细胞的炎症反应的研究很少。本研究扩大了高良姜素对炎症细胞的范围的探究,为高良姜素干预脓毒症的炎症反应提供更多依据。目的:本研究采用LPS刺激的巨噬细胞作为体外炎症模型,探索高良姜素是否能抑制该模型的炎症反应。内容与方法:1.用PMA(乙酰豆肉蔻佛波醇,Phorbol 12-myristate 13-acetate)诱导单核细胞(THP-1)成巨噬细胞。2.酶联免疫吸附(ELISA)法检测高良姜素对LPS诱导的巨噬细胞12、24小时后释放TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。3.MTS法(实时荧光?MT细胞活性检测)检测LPS处理12、24小时后高良姜素对巨噬细胞活性的影响。同时采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测LPS诱导巨噬细胞6小时后巨噬细胞凋亡率。4.酶联免疫吸附(ELISA)法检测高良姜素对LPS诱导的巨噬细胞12、24小时后TIMP-1的释放水平。用免疫印迹(Western blot)法检测LPS处理12小时后高良姜素对LPS诱导的巨噬细胞MMP-2、MMP-9蛋白水平的变化。结果:1.LPS的用药浓度为500ng/m L时,与LPS组相比,高良姜素+LPS组(2.5-20μM+500ng/m L)能有效抑制炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的释放(P<0.05)。2.高良姜素在0-20μmol/L范围内对LPS诱导的巨噬细胞活力无明显影响(P>0.05)。高良姜素在10、20μM时对LPS诱导的巨噬细胞凋亡率无明显影响(P>0.05)。3.与LPS组比,10、20μM的高良姜素能够抑制LPS诱导的巨噬细胞MMP-2的表达(P<0.05),20μM的高良姜素能够抑制LPS诱导的巨噬细胞MMP-9的表达(P<0.05),但对TIMP-1的表达无调节作用(P>0.05)。结论:高良姜素能够抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应,使得TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-2、MMP-9的表达下调。