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肠出血性大肠杆菌E.coliO157：H7是人类重要肠道致病菌之一，本研究选择鸡卵黄抗体拟实现对该致病菌的免疫检测。主要通过E.coliO157：H7特征抗原的选择、分离提取、以临产蛋母鸡作为免疫对象进行免疫，收集高免蛋，取出蛋黄并经分离纯化等操作获得鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)，选用辣根过氧化物酶(HRP)标记特异性IgY，建立针对E.coliO157：H7特征抗原的双抗体夹心ELISA检测法，并试行设计了E.coliO157：H7免疫检测试剂盒。
特征抗原选取脂多糖(LipopoLysaccharide，LPS)和O-特异性多糖(O-specificpoLysaccharide，OSP)作为主要研究对象，采用改良热酚水法分离提取。菌种经革兰氏染色、鞭毛染色及直接ELISA等鉴定血清型后，富集培养，3500r/min离心分离菌体并悬浮于无热源水中，与等量90％苯酚共加热至60℃后混合搅拌30min，冰浴至2℃，3500r/min离心20min，收集水相置于透析袋中透析60小时以上去酚，浓缩得LPS粗品。加DNase和RNase37℃酶解4h，100℃水浴10min，冷却至室温后1500r/min离心30min取上清，加丙酮沉淀获得纯化LPS。15g湿菌体提取后，经多糖、核酸、蛋白及鲎试剂凝集活性检测可获得75mg纯化LPS，提取率为0.5％。
纯化的LPS在1.5％醋酸中100℃水浴30min，1500r/min离心10min，取上清4℃下透析24h去酸，浓缩得OSP抗原。LPS、OSP及热灭活E.coliO157：H7与不完全弗氏佐剂充分混合制得LPS(120μg/mL)抗原、OSP(200μg/mL)抗原及菌体(108-109CFU/mL)抗原。
以上三种抗原对临产母鸡按每只鸡每次1mL剂量进行免疫，间隔15天，免疫四次。收集鸡蛋，应用间接ELISA监测卵黄抗体(IgY)产生，在免疫后35天抗体效价达到最高值，在60天时抗体效价明显下降，可持续至80天左右。
卵黄抗体的分离纯化采用微滤、超滤、盐析沉淀及离子交换方法。水稀微滤除脂，5万截流分子量超滤膜超滤浓缩，45％硫酸铵盐析沉淀得IgY粗品，0.8％PBS溶解，DEAE-SephadexA-50离子交换层析，pH7.0THS缓冲液，0.05mol/L平衡上样，0.135mol/L洗脱杂蛋白，0.185mol/L洗脱分离纯化IgY。SDS-PAGE和直接ELISA检测，达电泳纯，冻干IgY稀释至2.5mg/mL的抗体亦具有反应活性。
卵黄抗体的酶标记选用辣根过氧化物酶，采用改良过碘酸钠法。酶标抗体经效价、酶活性等测定，确定的最佳条件为：HRP与IgY质量比为1∶2，NaIO4浓度为0.10mol/L，室温条件下反应2小时。
基于实验所得抗体初步设计了E.coliO157：H7双抗体夹心ELISA法检测试剂盒。用10μg/mLIgY-antiOSP包被聚苯乙烯酶标板，酶标抗体(HRP-IgY-antiOSP)工作浓度为1：320。试剂盒性能评价结果显示：E.coliO157：H7的最低检出量为103CFU/mL，重复性达90％以上，可作为肠出血性大肠杆菌O157：H7等其它食源性病原菌快速诊断新的有效手段。