【摘 要】
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家蚕（Bombyx mori）是完全变态发育昆虫,在变态发育时期要经历剧烈的生理变化,发生着旧组织的退化、消亡以及新组织的产生。细胞自噬（Autophagy）是众多影响家蚕变态发育时期组织退化的因素之一。唾液腺是已知大多数动物分泌唾液润滑口腔的主要器官,这一功能对动物进食起重要的辅助作用。Relish作为NF-κB转录因子家族中的一员,具有调控抗菌肽（antimicrobial peptide,A
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家蚕（Bombyx mori）是完全变态发育昆虫,在变态发育时期要经历剧烈的生理变化,发生着旧组织的退化、消亡以及新组织的产生。细胞自噬（Autophagy）是众多影响家蚕变态发育时期组织退化的因素之一。唾液腺是已知大多数动物分泌唾液润滑口腔的主要器官,这一功能对动物进食起重要的辅助作用。Relish作为NF-κB转录因子家族中的一员,具有调控抗菌肽（antimicrobial peptide,AMP）转录的功能。最近在果蝇中的研究表明Relish也参与细胞自噬的调控,其调控作用是通过上调调控自噬相关基因（Autophagy-related,Atg）Atg1的表达而实现的。为了研究Relish在家蚕变态发育时期对细胞自噬的调控作用,本论文在克隆家蚕Relish基因的基础上,通过家蚕变态发育期BmRelishs、Atgs、AMPs等基因的表达分析和BmRelishs基因过表达的功能分析,研究Relish参与自噬的调控作用,为探讨变态发育期先天免疫和细胞自噬的相互作用关系奠定基础。论文获得的主要研究结果如下:（1）根据报道的家蚕BmRelish1（NM＿001102465.1）与BmRelish2（NM＿001105234.1）序列,从大造品种的家蚕幼虫脂肪体对BmRelishs基因进行RT-PCR扩增,获得了两条BmRelish1序列。保守结构域分析显示:两条序列中均含有Rel蛋白同源结构域（Rel homology domain,RHD）及锚蛋白重复序列（ankyrin repeat,ANK）,属于BmRelish1的两个亚型。将c DNA全长为2784bp的BmRelish1命名为BmRelish1-a,与报道的BmRelish1氨基酸序列一致性高达97.26%;另一条命名为BmRelish1-b,为2241bp,与报道的BmRelish1氨基酸序列一致性为78.43%。扩增得到的BmRelish2与报道的序列（NM＿001105234.1）一致。（2）通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）检测家蚕五龄幼虫至蛹变态发育时期脂肪体、中肠和唾腺中的BmRelishs的表达量,结果显示:在变态发育时期,脂肪体、中肠和唾腺中BmRelish1-（a+b）、BmRelish1-a及BmRelish2表达量均有显著上调,尤其是唾腺中最为明显。五龄幼虫期唾腺中Relishs的表达水平低,Relish1在预蛹期和蛹期1d表达量达到高峰,之后在蛹期2d急剧下降;而Relish2在蛹期2d表达量升高。（3）qPCR检测幼虫至蛹变态期唾腺中自噬相关基因（Atgs）和抗菌肽（AMPs）的表达,发现在唾腺中Atgs基因在化蛹变态发育时期随着发育进程而增加,在预蛹期和蛹期1d达到峰值,蛹期2d表达急剧下降至很低的水平;AMPs基因在预蛹期、化蛹初期出现表达量上调。与唾腺中Relish基因在变态发育期的上调趋势相似,猜测Relish的上调与变态发育时期的免疫或自噬等生理过程有关。（4）对家蚕五龄幼虫至蛹变态发育时期的唾腺进行形态观察,发现从预蛹期开始家蚕唾腺发生萎缩,且组织变的松散,表明此时的唾腺开始发生组织降解和退化。激光共聚焦扫描显微镜观察唾腺的Lyso Tracker Red染色结果显示,从预蛹期1天开始检测到红色荧光亮点,并在预蛹期2天红色荧光最强,说明家蚕唾腺从游走期开始发生细胞自噬,并在预蛹期2天达到较高水平。（5）将BmRelish1-a、BmRelish1-b、激活型Relish1和Relish2插入p IEx4表达载体,构建获得的重组表达载体转染Bm N细胞,Western blot检测表明BmRelish在Bm N细胞中成功表达。通过qPCR检测发现,过表达BmRelish1-a及BmRelish2使Atg5、Atg7、Atg12等基因的表达量上调。上述研究结果初步表明家蚕Relish转录因子具有参与自噬的调控功能,暗示了在家蚕变态发育期自噬和免疫通路之间可能通过共同的调控因子Relish发生相互调节的作用。
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