大豆是重要的粮食和油料作物，但容易受多种真菌病的危害，导致大豆的产量和品质下降。由于传统的抗病途径存在诸多缺点，并不是理想的防治措施，而利用基因工程技术可望为大豆育种及品质改良开辟一条新途径。但大豆抗真菌病基因遗传转化中仍存在单个抗病基因的抑菌谱窄、缺乏合适的再生体系和遗传转化效率低等问题。 针对以上问题，本研究选用东北地区4个主栽大豆品种为试材，通过基因工程手段，构建带有菜豆几丁质酶基因(chi)和大麦核糖体失活蛋白基因(rip)的植物表达载体，利用农杆菌介导法和基因枪法，首次将两个抗真菌病基因同时导入大豆。并系统优化植株再生和遗传转化条件，建立了高效的植株再生和遗传转化体系，获得同时整合两个抗真菌病基因的转基因大豆：本研究为大豆以及其它豆科植物抗病分子育种奠定基础，并为有性杂交育种提供基因资源。主要研究结果如下： 1．构建了抗真菌病基因植物表达载体 a 共构建5个载体，包括1个中间克隆载体pURO1、1个中间表达载体pARIP、2个单基因植物表达载体pBIRIP和pBchE、1个双价基因植物表达载体pBRC。 b．pBRC含有chi基因和rip基因，其联合表达有望扩大植物抗菌谱。 c．pARIP带有rip基因，与含有NPTⅡ和chi基因的pBch作为基因枪转化材料。 d．pBIRIP和pBchE都含有各自的抗真菌病基因和NPTⅡ选择标记基因，pBIRIP还含有Gus基因，均可作为抗真菌病遗传转化研究的目的基因材料。 二．改造了启动子 将pARIP、pBIRIP、pBchE和pBRC中的目的基因启动子均改造成双35S启动子，可显著增强目的基因在双子叶植物中的表达效率。 3．建立了大豆子叶节器官发生再生系统 a．最佳丛生芽分化培养基为MSB+1.5mg／LBA+0.2mg／LIBA，0.8％琼脂粉，pH5.8。 b．不同基因型的丛生芽分化率和每个外植体出芽数不同。在供试的4个大豆基因型中，黑农35、合丰35、东农42和吉林30的丛生芽分化率分别为98.5％、99.3％、73.4％和40.6％，每个外植体平均出芽数为4.9、5.0、3.0和3.0。黑农35和合丰35是子叶节发生途径的高效再生基因型。 c．最佳丛生芽生根培养基为1／2MSB+1.5mg／LIBA+2％蔗糖，0.8％琼脂粉，pH5.8。 d．基因型之间有生根率和启动时间上的差异。合丰35生根率最高，为95.1％，启动时间最短，为2天；黑农35、东农42和吉林30次之，生根率分别为62.2％、 博士学位论文 摘 要 芋海燕 60．8O和79．80，启动时间分别为4、4和3天。4．建立了大豆幼胚子叶体细胞胚发生再生系统 。用正交试验探讨氮源、生长素和蔗糖对体细胞胚诱导的影响。结果表明，最佳 体细胞胚诱导培养基为MSB＋40rngh 2，4LH6％蔗糖，08％琼脂粉，pHS．8 此时，体细胞胚诱导率和诱导效率最高，分别达49％和2．94％。蔗糖浓度是影 响体细胞胚诱导的首要因素，其次是生长素浓度，而有机氮素不是大豆体细胞 胚诱导所必需的。2，4－D的诱导效果好于NAA。 b 首次证明，高pH值与接种前的低温预处理可显著提高大豆体细胞胚诱导效军。 经4℃预处理、在pH70的培养基上获得的诱导效率最高，为4460／／0，与…．8。 不进行低温处理的结果（29％）差异极显著。这一结果将对大豆幼胚子叶体绍 胞胚发生影响因素的研究有重大参考价值c C 低温预处理的最适时间因基因型不同而有所差异．合丰35、黑农35为二大． 吉林30为1天，东农42为3天，其变动幅度为l～3天。 d 最佳体细胞胚成熟培养基为MSBed％蔗糖十0．3％活性炭，0．8％琼B旨扮，pHS．8。 此时，胚成熟宰最高，达87．5％c活性炭可减少畸形胚比率，提高胚成熟氧 e 干燥处理能显著提高子叶形胚萌发率c采用滤纸干燥法，在幻％相对湿度V失 水 72h，当鲜重损失率达 50o时，体细胞胚萌发率最高，为 92．10。5．忧化了农杆菌介导的子叶节遗传转化体系 a 首次构建并利用双价抗真菌病基因植物表达载体进行大豆子叶节遗传转化c b．合丰35是农杆菌转化理想的植物材料，其抗性芽率最高，为40．3％，显著高于 其它基因型。 c 正交试验结果表明，农杆菌介导转化的较优组合为：侵染时在0．06Mpa真空强 度下负压处理5分钟。共培养3天、预培养1天、共培养培养基的叫二，此 时抗性芽率最高，为55．8％c各因素影响的主次顺序为：共培养pH值＞负压处 理时间＞共培养时间＞预培养时间c d．丛生芽分化阶段卡那霉素的筛选压力确定为 130mg／Lc丛生芽生根阶段卡那霉 素的筛选压力确定为：黑农35、东农42和吉林30为lop，合丰35为15mgh。 e．采取分步筛选法，即在丛生芽分化和生根阶段都进行筛选。而在分化阶段，采 用延迟选择法，即共培养一周后再筛选，效果好于传统的一步筛选法。6．优化了基因枪法对幼胚子叶的遗传转化体系 a－ 首次将携带不同抗真菌病基因的两个质粒馄合轰击大豆幼胚子叶诱导的初生 胚