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豹蛙抗瘤酶（ONC）是一种提取自豹蛙的卵细胞,又被称为两栖酶、抗肿瘤酶p30蛋白等,属于核糖核酸酶A的超家族成员,对于肿瘤细胞具有很强的杀伤力。但豹蛙抗瘤酶是一种天然的蛋白质,所以来源有限,产量极低,限制了其在临床上的广泛应用,该问题用基因工程方法得到了很好的解决。此外,人血清白蛋白（HSA）有着广泛的生物学作用,用基因工程方法制备高表达重组的HSA能够在医疗方面得到很高的利用价值。将ONC的抗肿瘤特性和HSA的生物学作用结合起来,制备出一种高活性和高表达特性的融合蛋白,无论是在医学和研究上都会获得巨大的影响力。所以,本实验室利用HSA的高表达的特点,通过对连接肽的构思和设计,构建了HSA-ONC融合蛋白,既满足了豹蛙抗瘤酶的生物学活性,又满足了对表达量的要求。为了能使融合蛋白成功表达,在柔性连接肽（GGGGS）n的基础上,加入KNNNK,形成具有高度正负离子化和高度亲水性的G4SKNNNKG4S连接肽,使融合蛋白的水溶性有所提高,从而达到蛋白的分离纯化更容易进行的目的,希望该连接肽既可以不影响它连接的两个蛋白的生物学活性,又有利于保持甚至提高两个蛋白的表达量和对肿瘤细胞的选择性。本实验利用实验室具有的重组质粒pPIC9K?HSA和pPIC9K?ONC,在融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC之间加入提前设计好的连接肽G4SKNNNKG4S。步骤为:首先设计引物,用重叠PCR技术完成HSA-G4SKNNNK G4S-ONC序列的合成,将合成的序列连接到扩增载体pMD20-T上,形成重组（扩增）的质粒pMD20-T?HSA-G4SKNNNKG4S-ONC。将重组质粒导入大肠杆菌DH5α中进行培养,然后进行阳性克隆筛选和鉴定,将正确的阳性菌进行扩大培养。提取（扩增）质粒,用扩增好的重组质粒pPIC9K?HSA-G4SKNNNKG4S-ONC导入大肠杆菌DH5α中培养,筛选出正确的菌株扩大进行培养。然后提取重组（表达）质粒导入GS115毕赤酵母细胞中,构建GS115?pPIC9K?HSA-G4SKNNNKG4S-ONC毕赤酵母工程菌,筛选出正确的阳性毕赤酵母工程菌GS115?pPIC9K?HSA-G4SKNNNKG4S-ONC,留作后续实验使用。将上述毕赤酵母工程菌GS115?pPIC9K?HSA-G4SKNNNKG4S-ONC扩大培养,然后通过发酵进行培养,用1%的甲醇诱导其表达,用5d的时间进行诱导,将发酵液离心后,通过SDS-PAGE方法检测上清液中的融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC的表达情况同时,对融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC进行分离纯化,将上清液中融合蛋白蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,分离胶浓度为10%,电压为90V,温度为4℃,得到目的蛋白,离心收集上清,真空冷冻干燥,得到融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC粉末,置于-80℃保存备用。然后检测融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC是否具有生物活性,具体方法为:准备好体外培养24h的大鼠肝癌细胞CBRH-7919,分别用0μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、0.8μM、1μM、1.5μM、2μM不同浓度的融合蛋白进行处理,经过48h的处理后,用MTT显色法检测其细胞的活性,结果表明融合蛋白对大鼠肝癌细胞CBRH-7919的半致死量（IC50）为0.64±0.06μM,细胞的活性随着药物浓度的增加呈现逐渐减弱的趋势,并且表现出对浓度的依赖性。然后用流式检测细胞周期相的分布和凋亡率,结果表明经融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC处理过的大鼠肝癌细胞CBRH-7919,处于G0/G1期的细胞比例比对照组高,而处于S期和G2/M期的细胞比例开始减少,经过融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC处理过得细胞凋亡率与对照组相比明显增加,用Western Blot检测细胞内Caspas8、BAX蛋白的表达变化,结果促进细胞凋亡相关蛋白Caspas8、BAX表达上调,说明融合蛋白通过调节细胞凋亡相关蛋白表达来抑制肝癌细胞活性。综上所述,本文通过设计G4SKNNNKG4S连接肽,构建了重组（扩增）质粒pMD20-T?HSA-G4SKNNNKG4S-ONC、重组（表达）质粒pPIC9K?HSA-G4SKNNNKG4S-ONC和GS115?pPIC9K?HSA-G4SKNNNKG4S-ONC毕赤酵母工程菌,并且使融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC得到了成功的表达。分离纯化该蛋白并检测其生物学作用,发现融合蛋白对大鼠肝癌细胞通过调节细胞凋亡相关蛋白表达抑制肝癌细胞活性。