由于磷在土壤中的低溶解度和难移动性,使得其成为研究最广的植物大量矿质营养元素。油菜是我国重要的油料作物,其中甘蓝型油菜占我国油菜种植面积的80%以上。甘蓝型油菜需磷较多,对缺磷敏感,其栽培区又位于我国土壤磷缺乏或严重缺乏的地区。因此,研究甘蓝型油菜适应低磷胁迫的机制和磷营养高效的遗传机理,对于甘蓝型油菜磷吸收利用的遗传改良和栽培调控,以提高磷肥利用率,具有重要的理论和实践意义。本研究以课题组前期筛选出的磷高效基因型“鄂油长荚(Eyou Changjia)”和磷低效基因型“B104-2”为材料,应用双向电泳的蛋白质组学技术和基质辅助激光解析飞行时间质谱技术,分离鉴定两基因型根系、叶片中响应长期低磷胁迫和短期无磷饥饿下的差异蛋白;同时,应用Label-free技术对短期无磷饥饿下两基因型根系质膜蛋白进行定量与鉴定,获得一批响应磷饥饿的差异质膜蛋白。在此基础上,结合比较基因组学的方法,以课题组前期构建的甘蓝型油菜磷高效遗传连锁图谱为参考图谱,将差异蛋白定位到遗传连锁图上,建立差异蛋白与磷高效相关QTLs的联系,解析甘蓝型油菜磷胁迫的生理适应和耐受机制。获得的主要研究结果如下:1、长期低磷胁迫下的蛋白质组学分析以正常磷(200μM P)培养为对照,植株幼苗低磷(5μM P)胁迫18 d,然后转为正常磷培养培养2 d及5 d,取不同时间点根系和叶片样品,提取总蛋白进行蛋白组学分析。设有四个分析组,共分离鉴定到84个蛋白丰度发生显著改变的蛋白质点,其中分析组A(“B104-2”根系蛋白)19个、分析组B(“Eyou Changjia”根系蛋白)24个、分析组C(“B104-2”叶片蛋白)20个、分析组D(“Eyou Changjia”叶片蛋白)21个。2、短期无磷饥饿下的蛋白质组学分析以正常磷(200μM P)培养为对照,植株幼苗先在正常磷(200μM P)培养15d,然后转到无磷(0μM P)营养液中饥饿培养,分别在饥饿1 d、3 d和5 d时取根系和叶片样品,提取总蛋白进行蛋白组学分析。设有四个分析组,共分离鉴定了75个蛋白丰度发生显著改变的蛋白,其中分析组E(“B104-2”根系蛋白)16个、分析组F(“Eyou Changjia”根系蛋白)24个、分析组G(“B104-2”叶片蛋白)17个、分析组H(“Eyou Changjia”叶片蛋白)18个。3、两基因型中差异蛋白的功能分析磷缺乏下两基因型中发生差异的蛋白主要涉及防御与胁迫反应、碳水化合物与能量代谢、信号转导与调控、氨基酸及脂肪酸代谢、蛋白过程、细胞结构组分和功能未知蛋白。磷缺乏时8个分析组中防御与胁迫反应的差异蛋白有43个,其中76.7%为上调蛋白,主要与抗氧化相关。与磷低效基因型“B104-2”相比,磷高效基因型“Eyou Changjia”能更有效的抑制超氧阴离子(O2·-)的产生,降低膜脂过氧化水平。因此较强的抗氧化能力是甘蓝型油菜磷高效的机制之一。磷缺乏使得磷高效基因型中硫脂合蛋白sqd1上调以增加硫脂的合成替换细胞中的磷脂,为磷缺乏的细胞提供更多的磷。因而,细胞的膜脂重构为甘蓝型油菜磷高效的又一机制。磷缺乏也改变了两基因型中的碳水化合物代谢,参与此过程的差异蛋白有37个。磷缺乏下,磷高效基因型“Eyou Changjia”诱导形成胞质UDP-葡萄糖旁路代谢途径以绕开糖酵解途径中ATP和无机磷消耗大的途径。4、质膜纯化体系的建立与质膜蛋白质组学浅析通过比较分析5.8%-6.4%浓度下的葡聚糖-聚乙二醇两相分配体系对甘蓝型油菜根系质膜纯化的影响,建立了根系质膜纯化的技术体系:采用6.2%葡聚糖-聚乙二醇两相体系可得到高纯度(大约90%)且蛋白产量较高(大约6.5μg/g FW)的质膜组分。使用该技术体系纯化质膜后,采用label-free法进行质膜蛋白组学研究,共分离鉴定了71个差异质膜蛋白,磷高效基因型“Eyou Changjia”31个,磷低效基因型“B104-2”40个。按质膜蛋白的功能及参与的生化过程将质膜蛋白分为细胞骨架、细胞防御、转运蛋白、信号转导、蛋白修饰、蛋白合成与降解、代谢与能量转化、功能未知蛋白。5、比较基因组学方法建立差异蛋白与QTLs的联系利用比较基因组学的方法,将总蛋白中94个差异蛋白及35个质膜差异蛋白成功定位到遗传连锁图谱上,其中72个差异蛋白和30个质膜差异蛋白定位于磷效率系数、磷含量、干物质重等磷高效相关的QTLs置信区间内,建立了差异蛋白与QTLs之间的联系,为分离克隆QTLs区间内的基因提供基因信息。