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类胡萝卜素(carotenoid)是一类超过700种萜烯基团类不饱和化合物的总称,普遍存在于动物、植物、藻类、真菌和细菌中,具有重要的生物学功能,由于其鲜艳的色泽和抗氧化等特性被广泛地应用于食品、医药、化妆品和饲料等行业。掷孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)是一类主要积累三种类胡萝卜素(β-胡萝卜素、圆酵母素和红酵母红素),能够弹射孢子的酵母菌。八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶是类胡萝卜素生物合成途径中的关键酶,在掷孢酵母中是由一个双功能基因crtYB编码的。该酶能够催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP,无色)合成八氢番茄红素(phytoene,无色)和催化番茄红素(lycopene,粉红色)环化形成β-胡萝卜素(β-carotene,黄色),它们是类胡萝卜素从无色转变成有色的重要催化酶。crtYB基因的cDNA全长为1791bp,编码596个氨基酸。CrtYB的N-端编码番茄红素环化酶,C-端编码八氢番茄红素合成酶。本文利用重叠延伸PCR法对CrtYB进行定点突变,并采用实时荧光定量PCR的方法,对掷孢酵母CrtYB的功能进行研究。主要结论如下:(1)将位于八氢番茄红素合成酶结构域的第322位天冬氨酸突变为色氨酸,利用大肠杆菌异源互补检测法验证。最终确定定点突变基因crtYBD322W编码的八氢番茄红素合成酶功能丧失,并使番茄红素环化酶的环化功能减弱。证明第322位突变位点是CrtYB的关键功能位点。(2)同时发现,crtYBD322W在携带重组质粒的大肠杆菌中能够积累另一种类胡萝卜素,初步推测为番茄红素经过一次环化反应生成的中间产物γ-胡萝卜素,只积累了少量的β-胡萝卜素。说明CrtYB蛋白第322位突变位点不仅使其C-端八氢番茄红素合成酶的功能失活,而且还影响了 N-端番茄红素环化酶的功能。(3)利用高效液相色谱方法对掷孢酵母野生型NGR和黄化突变株Y9中类胡萝卜素的组分与含量进行分析得出:黄化突变株Y9的β-胡萝卜素积累量可达683.05 μg/g,高于野生型NGR的624.39μg/g;但NGR的圆酵母素积累量为249.59μg/g,高于黄化突变株 Y9 的 146.61μg/g。(4)经实时荧光定量PCR检测,在相同培养条件下,掷孢酵母黄化突变株Y9与野生型NGR比较,crtYB基因发生显著上调,crtI发生了上调,crtE发生了下调,但并不呈显著性差异。这表明基因crtYB的上调与黄化突变株Y9的β-胡萝卜素积累量增加有关,crtYB基因的表达量的上调使类胡萝卜素的合成偏向β-胡萝卜素一侧。掷孢酵母CrtYB的功能研究为构建工程菌合成类胡萝卜素提供了新思路。