论文部分内容阅读
乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤。虽然近年来早期诊断、手术、化疗、放疗、分子靶向治疗等综合手段的应用使乳腺癌患者的死亡率有所下降，但是仍然没有突破性的进展。乳腺肿瘤对化疗药物的耐药性是患者手术后复发、生存期缩短的一个重要原因。传统的肿瘤耐药性研究多关注于肿瘤本身，易忽略肿瘤力学微环境的影响。本文用聚（甲基丙烯酸2-羟乙酯）(poly(2-hydroxyethyl methacrylate)，poly-HEMA)包被的培养皿培养高转移性乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231模拟悬浮力学状态，研究悬浮力学状态对乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231耐药性和三磷酸腺苷结合盒亚家族C成员3(adenosine triphosphate binding cassette subfamily C member3，ABCC3)表达的影响，并探索核纤层蛋白A/C(Lamin A/C)在悬浮力学状态下对乳腺肿瘤细胞中ABCC3表达及其耐药性的影响。主要研究工作和实验结果如下: ①悬浮力学状态对MDA-MB-231细胞耐药性的影响 首先筛选甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)的浓度，MTS检测结果表明大于100μM的MTX药物处理不能进一步降低MDA-MB-231细胞的活性，且细胞形态观察发现MTX药物达到10μM时的细胞形态发生了显著变化，因此后续实验选择的药物浓度为0-100μM，且部分实验选择的药物浓度为10μM。MDA-MB-231细胞进行贴壁培养、悬浮培养24h或悬浮培养72h，然后再贴壁且同时加入MTX药物处理24h和72h。MTS检测细胞活性结果表明再贴壁24h时，悬浮再贴壁组细胞活性显著高于贴壁组，且悬浮72h组细胞活性高于悬浮24h组，但是再贴壁72h时，三组细胞之间的活性没有显著性差异。流式细胞术检测细胞周期结果表明，将MDA-MB-231细胞进行贴壁培养、悬浮培养24h或悬浮培养72h，然后再贴壁且同时加入10μM MTX药物处理24h，悬浮72h组增殖期细胞比例显著高于贴壁组和悬浮24h组，贴壁组和悬浮24h组之间增殖细胞比例没有显著性差异。 ②ABCC3在悬浮MDA-MB-231细胞中的表达及对耐药性的影响 通过实时定量PCR和Western blot分别检测细胞中ABCC3基因和蛋白的表达，利用MTS法检测细胞活性以及流式细胞术检测细胞的周期和凋亡情况。Western blot结果表明:与贴壁细胞相比，悬浮培养24h和72h的MDA-MB-231细胞内ABCC3蛋白的表达量分别上升1.76±0.35倍(P＜0.05）和3.78±1.16倍(P＜0.05)。将悬浮细胞再贴壁培养12h后其ABCC3蛋白的表达量又恢复到贴壁细胞的水平。在细胞中转染si-ABCC3后能够有效地抑制ABCC3基因和蛋白的表达。MTS实验结果表明:将转染si-Ctrl或si-ABCC3的MDA-MB-231细胞进行贴壁培养和悬浮培养72h，然后再贴壁且同时加入MTX药物处理24h时，敲低ABCC3能够显著降低细胞的活性，而再贴壁且同时加入MTX药物处理72h时，敲低ABCC3对细胞活性没有影响。流式细胞术结果表明:将细胞悬浮培养72h，然后再贴壁且同时加入10μM MTX药物处理24h，si-ABCC3组增殖期细胞比例为22.22±2.25％，显著低于si-Ctrl组(37.99±4.15％)(P＜0.01)。将细胞悬浮培养48h，然后用10μMMTX药物处理并继续悬浮培养24h，si-ABCC3组细胞的凋亡率为20.30±0.40％，显著高于si-Ctrl组(12.90±0.30％)(P＜0.01)。 ③Lamin A/C对细胞中ABCC3表达及其耐药性的影响 通过实时定量PCR检测细胞中LMNA和ABCC3基因的表达，Western blot检测Lamin A/C和ABCC3蛋白的表达，利用MTS法检测细胞活性以及流式细胞术检测细胞的周期和凋亡情况。Western blot结果表明:悬浮培养24h和72h的细胞中Lamin A/C蛋白的表达量分别为贴壁细胞的2.36±0.30倍(P＜0.01)和2.54±0.85倍(P＜0.05）。将细胞悬浮后再贴壁培养6h时其Lamin A/C蛋白的表达量又恢复到贴壁细胞的水平。在细胞中转染si-LMNA后能够有效地降低Lamin A/C和ABCC3的基因和蛋白表达水平。MTS实验结果表明，将转染si-Ctrl或si-LMNA的MDA-MB-231细胞进行贴壁培养和悬浮培养72h，然后再贴壁且同时加入MTX处理细胞24h时，敲低Lamin A/C能够轻度降低细胞的活性。而再贴壁且同时加入MTX处理72h时，敲低Lamin A/C对细胞活性没有影响。流式细胞术结果表明:将细胞悬浮培养72h后，然后再贴壁且同时加入10μM MTX药物处理24h，si-LMNA组增殖期细胞比例为24.20±3.20％，显著低于si-Ctrl组(37.99±4.15％)(P＜0.05）。将细胞悬浮培养48h后，用10μM MTX药物处理后继续悬浮培养24h，si-LMNA组细胞的凋亡率为23.90±1.70％，显著高于si-Ctrl组(13.20±1.70％)(P＜0.01)。 本文的研究结果表明悬浮力学状态能够通过诱导ABCC3过表达来提高乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231对MTX药物的耐药性，且悬浮诱导的ABCC3上调与Lamin A/C的累积有关。研究结果对于进一步探索悬浮力学状态对细胞耐药性影响的分子机制具有重要意义。