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背景高血压（Hypertension）是人类常见和多发疾病，其并发症脑卒中、心力衰竭等多种心血管疾病严重影响人类健康和发展，一直是心血管领域研究的重点内容。大量的研究显示肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)的增强与高血压病的发生、发展和预后关系十分密切，RAS通路上一些靶点的干预处理是治疗高血压病的主要策略之一。高血压病心血管功能异常主要表现为血压升高、交感兴奋性增强和压力反射功能低下等。除了外周RAS，在中枢神经系统内也存在一套不依赖于外周而独立的RAS，并参与了心血管活动的调节。AngiotensinII（AngII）是RAS中重要的生物活性多肽，在维持水、电解质平衡和调节血压中起重要作用,增强的AngII机制是高血压等心血管疾病的主要机制之一。延髓是人类的生命中枢，也是心血管活动的调节中枢，位于延髓的头端延髓腹外侧区（Rostral ventrolateral medulla，RVLM）是交感输出和血压调节的重要脑区，它不仅能够接受孤素核中继站介导的外周心血管信息的传入，还可发出传出纤维支配脊髓的交感节前神经元活动从而调控外周交感神经的活动，在维持交感紧张性和基础血压的作用中具有重要作用。一些研究提示，在RVLM中存在着多种神经递质及其受体系统，参与心血管活动的调节，其中AngⅡ及其受体在该区含量丰富。很多研究表明，AngII作用受体I型（AT1R）介导的RVLM内AngII效应是高血压等疾病中枢交感输出增加的重要机制，但目前对AT1R介导的机制并未完全明确。越来越多的研究证实，兴奋性氨基酸谷氨酸（Glu）突触传递功能加强是中枢神经系统内神经元兴奋的重要机制之一，RVLM内兴奋性氨基酸Glu受体的功能状态直接影响RVLM神经元的兴奋性，从而影响交感神经活动和动脉血压。有文献报道，谷氨酸突触传递功能的改变参与高血压的形成机制。Glu受体分为NMDA和AMPA/Kainate等受体亚型，这些受体的异常是影响Glu突触传递的一个重要因素，其中NMDA受体的磷酸化是导致Glu突触传递增强的重要机制。但目前并不清楚RVLM内AT1R介导的AngII效应与兴奋性氨基酸Glu及其受体能存在什么样的关系？因此本实验总体目标是明确兴奋性氨基酸Glu能突触传递在中枢AngII通过AT1R介导交感兴奋性中的作用及其机制，并进一步阐明这种相互作用在高血压交感输出增强中的作用和意义。本研究将为高血压交感神经活动亢进机制研究提供新的理论依据。方法本实验应用WKY和SHR动物模型，通过中枢微量注射、分子生物学（蛋白表达Wewtern Blot）、高效液相色谱法（HPLC）、免疫组化，血液动力学监测（BP、HR、RSNA）、压力反射敏感性、以及侧脑室和RVLM灌流等技术方法进行观察研究。结果1. NMDA受体磷酸化参与中枢AngII介导交感兴奋性增强1.11中枢急性微量注射AngII对正常血压WKY大鼠基础心血管活动的影响RVLM内单侧微量注射AngII（2pmol/100nl）能够显著增强心血管活动（△MAP=12±2mmHg；△HR=40±8bpm；△RSNA%=30±4%；），以上变化在3min内达到峰值，持续时间约为10min，30min后基本恢复，与aCSF对照组相比具有显著差异（P<0.05），注射前后WKY压力反射敏感性(BRS)无显著改变。1.12谷氨酸受体阻断剂Kynurenic Acid（Kyn）对中枢AngII心血管活动的影响RVLM内预处理AngII5min后给予2.7nmol Kyn能够明显(P<0.05)降低心血管活动，与AngII+aCSF组比较，RVLM单侧预处理AngII (2pmol)5min后给予Kyn后能够降低MAP(-28±2mmHg)、减缓HR (-25±4bpm)和降低RSNA（-50±2%）。1.13AngII对GluR的作用1.131AngII对Glu NMDA型受体作用RVLM单侧预处理aCSF5min后微量注射NMDA (20pmol)可引起MAP显著上(P<0.05)升(20±3mmHg)、HR加快(25±6bpm)以及RSNA（32±4%）加强；与aCSF+NMDA组比较，RVLM单侧预处理AngII (2pmol)5min后给予NMDA后能够引起显著(P<0.05)的大鼠MAP (30±2mmHg)上升、HR (54±6bpm)加快、RSNA（62±2%）活动增强。Losartan是AT1R特异性阻断剂，RVLM内预处理losartan（500pmol）5min后能够完全阻断AngII（2pmol）对NMDA的增强作用。1.132AMPA是Glu非NMDA受体激动剂，在RVLM内的心血管效应与NMDA很类似，与aCSF对照组比较RVLM单侧微量注射AMPA(5pmol)可引起M显著(P<0.05)MAP上升(18±4mmHg)、HR加快(30±5bpm)以及RSNA（34±4%）加强(P<0.05)。但是预RVLM单侧预处理AngII (2pmol)5min后并不改变(P>0.05)给予AMPA对MAP (19±2mmHg)、HR(28±4bpm)和RSNA（30±2%）的作用。1.14NMDA受体阻断剂DAP-5对AngII心血管效应的影响DAP-5是NMDA型受体特性阻断剂，RVLM单侧微量注射DAP-5不明显影响MAP（104±4vs102±2mmHg）、HR（410±10vs416±8bpm）和RSNA%（5±1vs7±6%），与对照组aCSF+AngII相比较，RVLM内单侧微量注射DAP-55min后能够显著抑制RVLM内AngII导致的升高血压MAP（20±4vs15±6mmHg）、HR（48±7vs36±8bpm）和RSNA（70±4vs50±8%）(P<0.05)。1.21Kyn对侧脑室（ICV）急性灌流AngII对WKY大鼠的心血管抑制作用RVLM内灌流AngII（800pmol）1hour，与aCSF对照组（MAP=3±1mmHg；HR=5±2bpm；RSNA=3±2%）相比AngII组（MAP=20±4mmHg；HR=6±4bpm；RSNA=20±4%）心血管活动增强，但心率无显著差异，1小时后RVLM内微量注射kyn2.7nmol，侧脑室预处理AngII组MAP（14±4mmHg）下降，心率（12±2bpm）减慢，RSNA（18±4%）减弱，与aCSF对照组相比有显著差异(P<0.05)。1.22侧脑室慢性灌流AngII7days对WKY大鼠基础心血管活动及代谢影响1.221ICV慢性灌流AngII对WKY大鼠基础心血管活动与aCSF对照组相比较，ICV灌流AngII组能够显著提高基础MAP（4±2vs40±2mmHg,n=6）的改变、而HR（6±2vs8±4bpm,n=6）无显著差异，且抑制大鼠压力发射敏感性BRS（bpm/mmHg）；而AngII+losartan灌流组与AngII灌流组相比,MAP（6±3vs40±2mmHg,n=6）上升减弱，具有显著差异(P<0.05)、HR（6±4vs8±4bpm,n=6）无变化(P>0.05)；1.222AngII慢性ICV灌注对WKY大鼠代谢活动影响与灌流前相比较aCSF对照组和AngII+losartan实验组体重（aCSF:265±2vs267±2g;AngII+losartan:270±2vs266±2g），24小时摄水量（aCSF:28±2vs25±1ml;AngII+losartan:29±2vs26±3ml）以及尿量（aCSF:11±4vs10±4ml;AngII+losartan:12±4vs11±2ml）无显著差异（P>0.05）；AngII实验组体重（265±3vs246±2g）、摄水量（26±3vs53±4ml）以及尿量（12±3vs21±6ml）有所增加，并具有统计学差异（P<0.05）；1.23ICV慢性灌流AngII7days后，RVLM中微量注射Glu受体阻断剂kyn对心血管活动的影响慢性ICV给予aCSF或AngII（800pmol）灌流7days，与aCSF对照组相比较，AngII灌流组能够显著提高基础MAP（4±2vs40±2mmHg,n=6）的改变、而HR（6±2vs8±4bpm,n=6）无差异；与aCSF灌流组相比，AngII灌流后RVLM内注射Glu受体阻断剂kyn2.7nmol能够明显降低MAP（4±3vs-20±2mmHg）、HR(5±2vs-25±13bpm)以及RSNA（2±2vs-18±1%）（P<0.05）1.24RVLM急性微量注射AngII对WKY大鼠AT1R、NMDA受体磷酸化（P-NMDA）蛋白表达Western Blot显示，与aCSF对照组相比，AngII组RVLM内AT1、及P-NMDA蛋白表达上调（P<0.05）。而losartan可以明显抑制NDMA受体磷酸化（P<0.05）。1.25侧脑室慢性灌流AngII对WKY大鼠AT1R、NMDA以及P-NMDA蛋白表达Western Blot显示，与aCSF对照组相比，AngII组RVLM内AT1R、NMDA及P-NMDA蛋白表达上调。2.1自发性高血压大鼠（SHR）RVLM急性微量注射Kyn能够显著抑制其心血管活动RVLM微量注射aCSF不引起SHR心血管功能显著改变(P>0.05)。与aCSF对照组比较，RVLM内微量注射kyn（2.7nmol）能够显著抑制SHR的心血管活动，MAP（2±2vs-30±2%）、HR（1±4vs-11±13%）和RSNA（-1.5±2vs-18±1%）；losartan是AT1R特异性阻断剂，RVLM单侧微注AT1R阻断剂losartan （500pmol）对SHR的MAP（2±2vs4±5%）、HR（1±4vs2±4%）与aCSF相比较，并无差异(P>0.05)；与aCSF对照组比较单侧预处理losartan5min后给予kyn可显著削弱kyn导致的MAP（-30±2vs-7±5%）、HR（-11±13vs-5±3%）和RSNA（-18±1vs6±3%）(P<0.05)等抑制效应。2.2侧脑室慢性灌流losartan7days对SHR基础心血管活动及代谢影响2.221ICV慢性灌注losartan对SHR基础心血管活动的作用与aCSF对照组相比较，losartan （4ug/h7ays）灌流组能够显著降低MAP（3±2vs-50±2mmHg,n=6）、HR（4±2vs-62±8bpm,n=6），且改善大鼠压力发射敏感性BRS（bpm/mmHg）；(P<0.05)2.222losartan慢性ICV对SHR代谢活动影响与灌流前相比较aCSF对照组体重（aCSF:276±2vs278±4g;），24小时摄水量（aCSF:53±2vs55±1ml）以及尿量（aCSF:11±3vs12±4ml）无显著差异（P>0.05）；losartan实验组体重（280±2vs258±2g）、摄水量（50±2vs36±3ml）以及尿量（12±4vs15±2ml）有所降低，并具有统计学差异（P<0.05）；2.3losartan慢性ICV7days后，RVLM中微量注射Glu受体阻断剂kyn慢性ICV给予aCSF、losartan（800pmol）灌流7days，与aCSF对照组相比较，灌流后RVLM内给予kyn2.7nmol能够明显降低MAP（-30±3vs-14±2mmHg）、HR(-20±6vs-12±8bpm)（P<0.05）2.4SHR微量注射losartan对RVLM内AT1R、NMDA以及P-NMDA蛋白表达Western Blot显示，与aCSF对照组相比，losartan组RVLM内AT1R、及P-NMDA蛋白表达下调（P<0.05），NMDA受体无差异（P>0.05）。提示losartan可以明显抑制NDMA受体磷酸化（P<0.05）。结论本研究明确中枢AngII通过AT1R介导NMDA受体磷酸化导致交感兴奋性增加和血压升高，并进一步证实自发性高血压大鼠模型中，AngII上调的NMDA受体磷酸化是高血压和交感兴奋性增强的重要机制。以上结果为高血压交感神经活动亢进的机制研究提出新的理论基础。