马尔尼菲篮状菌(Talaromyces marneffei,TM)是一种温度诱导双形态真菌,25℃表现为霉菌状,37℃或人体内表现为酵母状,酵母状为其致病相。可感染免疫缺陷人群,尤其是免疫受损严重的HIV阳性患者,能引起严重的播散性马尔尼菲篮状菌病(Talaromyces Marneffei,TSM),若得不到有效治疗,病死率极高。该病区域性流行于东南亚和我国广西,广东,云南,香港等南方地区。其传播途径最常见是经呼吸道吸入马尔尼菲篮状菌孢子导致感染。研究表明从菌丝相到酵母相的形态转变是双相真菌毒性所必需的,该双相形态转换特性与其致病性密切相关,在酵母状态可特异性表达多种毒力因子。马尔尼菲篮状菌它从霉菌相转致病性酵母相的过程中不仅在细胞形态方面发生变化,且在细胞壁的组成成分、抗原分子和毒性的发生等方面也发生改变。但目前其双相转换特性及其致病性的分子机制研究尚不透彻。细胞壁完整性压力应答组分(cell wall integrity and stress response component)Wsc蛋白介导的CWI-MAPK信号通路在真菌细胞对外界环境压力应答中起重要作用。研究表明WSC蛋白介导的CWI-MAPK信号通路在酵母中参与对热、H202、乙醇和低渗等环境压力的应答,最终产生细胞壁合成酶来维持细胞壁的完整性以适应环境变化。Wsc3蛋白是酵母细胞膜上检测细胞壁受环境压力干扰的一种传感蛋白。在进行Pathway显著性富集分析不同生长时相差异表达基因时发现MAPK途径与酵母同源的压力应答传感蛋白基因Wsc3及其下游的MpkA基因在酵母相中表达显著下调。根据这一结果,我们推测WSC蛋白介导的CWI-MAPK信号通路可能在马尔尼菲的双相转换以及致病性调控中发挥重要作用,并且这两条途径在发挥作用后可受到适应性反馈抑制。近几年来,马尔尼菲篮状菌的双相转换机制越来越受到研究者的关注,普遍认为该机制与它的致病性紧密相关。因此课题组对马尔尼菲标准菌株进行了链特异性转录组测序,分析发现在其双相转换过程中的酵母相,菌丝相,酵母转菌丝相及菌丝转酵母相四个不同时相CWI-MAPK信号通路中的相关基因Wsc3,MpkA表达差异明显,分析结果显示Wsc3,MpkA基因在酵母相及菌丝转酵母过程中表达量较低,而在菌丝相及酵母转菌丝过程中表达量增加,该现象在CWI信号通路中的Wsc3基因表达尤其明显。Wsc3,MpkA这两种基因在双相转换中的差异性表达,猜测它们可能会在马尔尼菲篮状菌的双相转换机制中发挥一定的作用。因此我们想通过研究这两种基因的功能,来探究CWI-MAPK信号通路在马尔尼菲篮状菌的双相转换和致病机制中的作用及特征,为进一步明确该真菌的致病机理奠定重要基础。目的:通过研究在CWI-MAPK信号通路中不同时相表达差异显著的Wsc3,MpkA基因功能,以进一步阐明马尔尼菲篮状菌中CWI-MAPK信号通路的作用特点与其双相转换机制及其致病机理。方法:通过同源重组方法将目的基因进行敲除,从而获得基因突变株,然后通过将它们与野生株Spm4进行对比,观察基因缺失突变株在25℃和37℃不同培养基上的形态变化,以及对各种压力应激物敏感性的变化,如细胞壁压力,氧化应激,渗透压,药物,温度等,初步探究及了解目的基因功能。结果:(1)成功构建目的基因Wsc3,MpkA缺失突变菌株;(2)对比野生株Spm4,MpkA基因缺失菌株对细胞壁压力SDS、刚果红,盐压力NaNO2及抗真菌药米卡芬净敏感性增加,对细胞壁压力CFW,氧化压力,渗透压力D-Sorbitol,盐压力KCl和NaCl及抗真菌药物氟康唑敏感性略微增加;(3)Wsc3基因缺失菌株仅对细胞壁压力刚果红敏感性增加,对细胞壁压力SDS、CFW敏感性略微增加,对其他压力应激变化不明显。结论:(1)基于基因同源重组,采用断裂标记基因方法成功构建了Wsc3和MpkA基因缺失突变菌株;(2)马尔尼菲篮状菌Wsc3和MpkA基因参与调控对细胞壁压力、氧化压力、盐压力、高渗透压力以及温度压力敏感性,MpkA基因作用更明显。