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目的：研究腺病毒介导的Wnt10b高表达或表达抑制对人骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨成脂分化平衡的影响,探索Wnt10b通过经典Wnt信号通路调节人BMSCs成骨成脂分化的作用机制,为靶向Wnt10b基因治疗骨质疏松症提供实验数据和理论依据。方法：临床筛选行全髋置换术患者(n=10)的骨髓液,应用percoll梯度离心法分离出骨髓单核细胞,利用人BMSCs贴壁生长的特性纯化人BMSCs,然后对其进行传代培养,并应用流式细胞术鉴定人BMSCs;最后,选取2-4代的人BMSCs进行成骨和成脂诱导,并定期应用碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红(Alizarin Red S)染色和油红(Oil Red-O)染色分别对人BMSCs向成骨和成脂分化的情况进行检测。构建腺病毒载体(Ad-Wnt10b, Ad-Wnt10b-shRNA, Ad-Null)并对其进行鉴定；将构建成功的腺病毒载体瞬时转染人BMSCs-包括四组：Wnt10b组(Ad-Wnt10b)、Wnt10b干扰组(Ad-Wnt10b-shRNA)、空病毒组(Ad-Null)和空白对照组,然后应用免疫荧光检测各组细胞腺病毒载体转染效率,并将转染成功的细胞转入含诱导液的培养基中进行培养(成骨诱导、成脂诱导或正常培养),定期应用荧光定量PCR、ALP染色、免疫荧光和Western blot对成骨分化的特异性功能基因(ALP)和调控成骨分化的关键转录因子(Runx2)及成脂分化的特异性功能基因(FABP4)和调控成脂分化的关键转录因子(PPARy2)的mRNA及蛋白的表达量进行检测,并观察细胞形态学变化(茜素红染色、油红染色),最后综合分析Wnt10b基因高表达或表达缺失后对人BMSCs向成骨或成脂分化的影响。结果：成功应用percoll梯度离心分离出骨髓单核细胞,并根据贴壁生长的特性纯化出人BMSCs,细胞鉴定成功并顺利培养传代,并在成骨或成脂诱导的条件下分别分化为成骨或成脂细胞。成功构建腺病毒载体(Ad-Wnt10b, Ad-Wnt10b-shRNA, Ad-Null)并转染人BMSCs;转染6h后,免疫荧光检测各组腺病毒载体转染成功。诱导3d后,荧光定量PCR检测显示：成骨诱导组的成骨分化特异性功能基因(ALP)和调控成骨分化的关键转录因子(Runx2)及成脂诱导组的成脂分化特异性功能基因(FABP4)和调控成脂分化的关键转录因子(PPARy2)的表达明显高于正常培养组,且Wnt10b组相关成骨因子的表达高于其他对照组,相关成脂因子表达低于其他对照组,而Wnt10b干扰组的结果与Wnt10b组相反。诱导7d后,成骨诱导组Wnt10b组的ALP染色呈强阳性,ALP定量高于对照组,而Wnt10b干扰组为弱阳性,ALP定量低于对照组；免疫荧光和Western Blot检测显示：成骨诱导Wnt10b组的成骨相关蛋白ALP和Runx2的表达高于对照组,Wnt10b干扰组则低于对照组,而成脂诱导Wnt10b组的成脂相关蛋白FABP4和PPARγ的表达低于对照组,Wnt10b干扰组则高于对照组。诱导14d后,成脂诱导Wnt10b干扰组Oil Red-O染色呈现强阳性,Wnt10b组为弱阳性；诱导21d后,成骨诱导Wnt10b组Alizarin Red S染色呈现强阳性,Wnt10b干扰组为弱阳性。结论：人BMSCs的分离、培养、鉴定及成骨成脂诱导成功；Wnt10b基因高表达能够促进人BMSCs向成骨分化,同时抑制其成脂分化；而阻遏Wnt10b基因的表达,则抑制人BMSCs成骨分化的同时促进其向成脂分化。