研究背景胚胎冷冻保存就是使用特殊的保护剂和降温措施对早期动物胚胎进行冷冻,使其在-196℃的液氮中停止细胞的生化活动,降低新陈代谢,在复苏后又能恢复代谢能力,从而实现长期保存胚胎的一种生物技术。无论在新鲜周期还是冻融周期中,选择发育潜能较好的胚胎优先移植,提高种植率并降低多胎率仍是各生殖中心的目标之一,与此同时因超促排卵治疗所带来的多余胚胎,同样也受到越来越多世界各地生殖医学专家关注。1983年Trounson and Mohr首次将胚胎冷冻-解冻技术运用于人类胚胎,并获得临床妊娠,随后冷冻技术不断革新,如今已普遍应用于世界各地。在体外授精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)对不孕症的治疗过程中大约有40%-60%[4]的患者行新鲜胚胎移植后仍有多余良好胚胎,使用胚胎冷冻技术可以合理限制移植胚胎数,降低多胎妊娠的发生,还可为移植失败、流产患者提供再次移植的机会,提高IVF的累计妊娠率,减少了患者因反复控制性超促排卵产生的痛苦及经济压力。此外对因超促排卵所致中、重度卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS)风险而不宜行新鲜移植的患者,将其胚胎冷冻保存,择期移植可有效的提高周期累计妊娠率。影响冻融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer, FET)能否获得妊娠的因素有很多,就胚胎而言包括冷冻前胚胎发育速度和形态学评价、复苏后胚胎损伤程度以及卵裂球复苏情况。本研究旨在探讨胚胎发育速度和冷冻——解冻后胚胎不同体外培养时间与FET妊娠结局的关系,从而更好的为FET周期挑选较高植入潜能和发育潜能的胚胎提供参考,以提高冻融胚胎移植周期妊娠率。第一部分卵裂期胚胎发育速度及冷冻解冻后不同体外培养时间对FET助孕结局的影响目的：探讨卵裂期胚胎发育速度及冷冻解冻后不同体外培养时间对FET助孕结局的影响方法1、研究对象回顾性研究2012年1月至12月南方医院生殖中心行FET助孕治疗患者共661个移植周期,纳入标准：①符合IVF／卵泡浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)治疗的一般标准；②取卵周期采用标准黄体中期长方案、拮抗剂方案者；③新鲜周期移植失败或者取消移植,2-3个月内行自然周期、自然周期+人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)、促排卵周期、无垂体降调节的激素替代周期冻融胚胎移植；④FET周期移植2-3个卵裂期胚胎。IVF指征为输卵管因素、子宫内膜异位症、排卵障碍等；ICSI指征为男方严重少弱精子症、阻塞性无精子症、逆行射精、前次IVF受精失败；ICSI精子来源于射精、附睾抽吸、睾丸活检。排除标准：①新鲜周期行coasting方案；②FET周期行两步移植以及解冻胚胎行囊胚培养后移植周期；③异常受精者；④子宫腺肌症、粘膜下肌瘤、宫腔粘连、宫腔积液、子宫内膜息肉、子宫内膜增生以及盆腔结核等明确影响子宫内环境因素的患者；⑤冻融前后行辅助孵化者；2、FET妊娠结局相关性指标的确定方法运用双变量相关分析3、分组方法根据冷冻前D3胚胎卵裂球数将冻融移植周期胚胎分为三组,A组：均为6～8细胞；B组：均为<6细胞；C组：均为>8细胞,另移植多个胚胎的卵裂球数分组不一致的胚胎移植周期不纳入本部分研究。再根据胚胎解冻后体外培养时间分组,分为D组(解冻后体外培养2～4h,第3天移植)和E组(解冻后体外培养18～24小时,第4天移植)。其中,根据解冻后体外培养2～4h内胚胎卵裂球复苏情况将D组分为D1(即：所移植的所有胚胎卵裂球均存活未丢失)和D2(即：所移植的所有胚胎至少有一个卵裂球丢失但丢失比例<50%)。根据解冻后体外培养18-24小时内胚胎恢复有丝分裂的情况将E组分为E1(即：所有胚胎均恢复有丝分裂的FET周期组)和E2(即：部分胚胎恢复有丝分裂的FET周期组)。4、FET移植原因新鲜周期移植失败或者取消新鲜周期移植。5、冷冻周期子宫内膜准备方式采用自然周期、促排卵周期(HMG)、无垂体降调节的激素替代周期和自然周期+HCG6、实验室处理、胚胎冷冻与复苏、黄体支持及妊娠诊断根据男方精液处理后的质量选择IVF/ICSI受精,原核的观察在受精后的16-18小时进行,D2胚胎的观察在受精后的44±1小时进行,D3胚胎的观察在受精后的68±1小时进行。取卵后72h根据患者年龄、既往移植情况及有无OHSS症状选择该患者所有胚胎中最好的1-3枚进行移植,剩余胚胎在征得患者知情同意后,根据我中心的冻存标准予以冷冻保存。胚胎冷冻与复苏、黄体支持及妊娠诊断方法均按照本中心常规进行操作。7、统计学分析采用SPSS13.0软件数据包对数据库进行统计学分析,结果以均数加减标准差(χ±S)或率(%)来表示。剂量资料满足方差齐性检验时,采用独立样本t检验或者one-way ANOVA,不满足方差齐性检验时,则采用非参数的Kruskal-WallisH检验；率的比较用卡方检验；双变量相关分析中,对于正态分布的双变量资料,采用Pearson相关系数分析；非正态分布的双变量资料,用Spearman相关系数分析,多变量相关分析采用二分类logistic回归。以P<0.05为差异具有统计学意义,在表中直接以P值表示,P≥0.05为无明显统计学差异,在表中表示为NS。结果1、本研究共661个FET周期,解冻1634枚胚胎,复苏存活1615枚胚胎,复苏率为98.8%,移植1511枚胚胎,着床423枚,胚胎着床率为27.99%。661个FET周期中,281个周期获得临床妊娠,临床妊娠率为42.5%。FET妊娠结局与助孕方案、受精方式、FET移植原因以及FET周期子宫内膜准备方案无相关性(P>0.05)；与冷冻胚胎解冻后体外培养时间成正相关(r=0.08,p=0.04),但相关性不大；与新鲜周期胚胎发育的速度呈正相关(r=0.113,P=0.009)。2、A、B、C三组间患者年龄、不孕年限、新鲜周期促排方案构成比、新鲜周期授精方式构成比、FET周期子宫内膜准备方案构成比、子宫内膜厚度、每周期移植胚胎数之间均无统计学差异(P>0.05)。三组间胚胎复苏率(P=0.007)、临床妊娠率(P=0.003)、以及胚胎种植率(P=0.007)比较具有显著性差异。三组间解冻后100%卵裂球存活率、多胎率、自然流产率比较无显著性差异(P>0.05)。将解冻后卵裂100%存活周期与非100%存活周期的妊娠结局进行比较。发现胚胎种植率、临床妊娠率以及自然流产率之间均无统计学差异(P>0.05)。3、通过校正D组和E组患者新鲜周期促排卵方案构成比、受精方式构成比、FET子宫内膜准备方案构成比、子宫内膜的厚度和每移植周期胚胎数等混杂因素对助孕结局相关指标评价带来的影响,行logistic回归分析发现D组与E组比较在胚胎种植率(95%CI0.745；1.152,P=0.493)、临床妊娠率(95%CI0.908；1.408,P=0.272)、自然流产率(95%CI0.538,1.378,P=0.533)以及多胎妊娠率(95%CI0.861；1.727,P=0.265)之间均无统计学差异。4、D1、D2组比较胚胎种植率(29.60%VS.27.60%,P>0.05)、临床妊娠率(44.40%VS.46.90%,P>0.05)、自然流产率(12.50%VS.17.40%,P>0.05)多胎妊娠率(39.70%VS.39.10%,P>0.05)之间均无统计学差异。5、E1、E2组间自然流产率相比无无统计学差异(P>0.05),胚胎种植率(30.40%VS.15.70%,P=0.000)、临床妊娠率(45.50%VS.25.00%,P=0.001)、多胎妊娠率(35.30%VS.9.50%,P=0.020)相比均具有统计学差异。结论1、冷冻胚胎解冻移植获得妊娠的关键在于冷冻前胚胎发育速度,6-8细胞和>8细胞的胚胎在FET周期均能获得较理想的种植率和妊娠率,但6-8细胞的胚胎优于>8细胞的胚胎,与存活胚胎卵裂球丢失与否无明显相关。2、解冻后胚胎体外培养时间不影响FET周期助孕结局,体外培养环境中胚胎发育不良,不能说明其在体内同样发育不良。3、解冻后延长体外培养时间时,移植胚胎全部恢复有丝分裂组能获得较好的胚胎种植率、临床妊娠率,但其发生多胎妊娠的风险也会相应增高。因此可能导致妊娠后期产科并发症的发生率增加。第二部分新鲜周期囊胚形成时间及冻融周期移植个数对FET妊娠结局的影响目的：探讨新鲜周期囊胚形成时间及冻融周期移植个数对FET周期妊娠结局的影响,从而为临床工作提供参考。方法：1、研究对象回顾性研究2012年1月至12月南方医院生殖中心接受囊胚-FET治疗患者共167个移植周期。1.1纳入标准①年龄<40岁患者；②在我中心首次行囊胚-FET,移植囊胚1-2个；③新鲜周期移植失败或者取消移植,至少间隔2个月内再行FET；1.2排除标准①新鲜周期行coasting方案；②FET周期所移植囊胚在新鲜周期培养过程中发育速度不一致；③异常授精者；④存在影响子宫内膜环境因素的患者；⑤冷冻前为正在孵出或者已经完全孵出的囊胚。2、分组标准按照新鲜周期囊胚形成速度分三组：A组为冷冻第五天形成的囊胚；B组为冷冻第六天形成的囊胚；再根据每移植周期相同囊胚形成时间不同移植个数将A组分为A1组(单囊胚移植)和A2组(双囊胚移植)；将B组分为B1组(单囊胚移植)和B2组(双囊胚移植)；3、控制性超促排卵、取卵,精液收集,优化处理以及体外授精方式的选择、FET周期内膜准备方案同论文第一部分。4、囊胚冷冻及复苏、移植后黄体支持、临床妊娠诊断、观察指标同论文第一部分。5、统计学方法采用SPSS13.0软件数据包对数据库进行统计学分析,结果以均数加减标准差(χ±S)或率(%)来表示。计量资料满足方差齐性检验时,采用独立样本t检验或者one-way ANOVA,不满足方差齐性检验时,则采用非参数的Kruskal-WallisH检验；率的比较用卡方检验；双变量相关分析中,对于正态分布的双变量资料,采用Pearson相关系数分析；非正态分布的双变量资料,用Spearman相关系数分析,多变量相关分析采用二分类logistic回归。以P<0.05为差异具有统计学意义,在表中直接以P值表示,P≥0.05为无明显统计学差异,在表中表示为NS。结果1、本研究共163个移植周期,平均年龄(30.76±4.50)岁,不孕年限(4.65±3.12)年,共解冻胚胎292枚,复苏后存活286枚,本研究的解冻复苏率97.95%,移植胚胎共279枚,种植胚胎数为69枚,胚胎种植率为24.73%,共移植163个周期,妊娠56个周期,妊娠率为34.36%,在囊胚冷冻移植周期中,A、B两组患者胚胎种植率具有统计学差异(P=0.042),且A组>B组,而临床妊娠率、自然流产率比较无统计学差异(P均>0.05)。2、A1、A2两组患者年龄、不孕年限、新鲜周期超促排方案构成比、取卵后授精方式构成比、FET周期内膜准备方式、子宫内膜厚度、囊胚冷冻复苏率、胚胎种植率、临床妊娠率以及自然流产率两组之间比较均无统计学差异(P>0.05)。3、B1、B2两组患者年龄以及不孕年限差异具有统计学意义(P=0.000,P=0.001),且均为B1组>B2组,其余新鲜周期超促排方案构成比、取卵后授精方式构成比、FET周期内膜准备方式、子宫内膜厚度、囊胚冷冻复苏率、胚胎种植率、临床妊娠率以及自然流产率两组之间比较均无统计学差异(P>0.05)。通过校正B1组、B2组患者年龄及不孕年限等混杂因素对妊娠结局相关指标评价带来的影响,行logistic回归分析发现两组比较在临床妊娠率(95%C10.152；0.966,P=0.042)具有统计学差异,而自然流产率(95%CI0.159；15.205,P=0.705)无统计学差异。4、A1、B1两组患者年龄、不孕年限、新鲜周期超促排方案构成比、取卵后授精方式构成比、FET周期内膜准备方式、子宫内膜厚度、囊胚冷冻复苏率、胚胎种植率、临床妊娠率、以及自然流产率两组之间比较均无统计学差异(P>0.05)。然而两组间胚胎种植率以及临床妊娠率虽然比较无显著差异,但A1明显大于B1。5、A2、B2两组患者年龄、不孕年限、取卵后授精方式构成比、新鲜周期超促排方案构成比、子宫内膜厚度比较组间无统计学差异(P>0.05),而FET周期内膜准备方式两组间具有统计学差异(P=0.042)；两组囊胚冷冻复苏率、临床妊娠率、以及自然流产率两组之间比较均无统计学差异(P>0.05),而胚胎种植率两组比较具有统计学差异(P=0.042),且A2组>B2组。通过校正A2、B2两组患者FET内膜准备方案构成比这一混杂因素对囊胚-FET妊娠结局相关指标评价带来的影响,行logistic回归分析比较两组临床妊娠(95%CI0.192；0.976,P=0.020)组间有统计学差异、自然流产率(95%CI0.090；1.802,P=0.234)之间无统计学差异。结论1、D5、D6形成的囊胚冷冻后-复苏后,胚胎存活率无显著差异,说明不同发育阶段的3-4期优质囊胚经过玻璃化冷冻保存后不会影响其复苏存活率。2、D5囊胚较D6囊胚,经玻璃化冷冻解冻移植后,可获得的更高胚胎种植率和临床妊娠率以及更低的自然流产风险,因此在临床实践工作中我们应该优先选择D5囊胚,其次是D6囊胚。3、D5囊胚冷冻移植时可考虑采用单胚胎移植,以减少多胎妊娠和自然流产风险,同时也有助于降低孕妇及胎儿的远期并发症；而对于D6囊胚而言,应选择双囊胚移植以获得更为理想的治疗效果。