丝状真菌卫氏木霉(T.reesei)是纤维索酶、半纤维素酶的主要工业生产菌株，该菌是美国FDA认证的食品安全级的工业生产菌株，具有强大的蛋白分泌能力，其中纤维二糖水解酶I(CBH1)占其外分泌蛋白的60％以上。里氏木霉具有与高等哺乳动物相似的糖基化系统和蛋白修饰分泌机制。因此，开发可用于高效表达异源蛋白的里氏木霉优秀宿主具有非常广泛的应用价值。本文本着建立高效的里氏木霉表达宿主为目的，根据里氏木霉基因表达的特点，分别在高产异源蛋白的里氏木霉菌株高通量筛选、通过调控内源蛋白的表达水平提高异源蛋白产量、基因组范围内寻找有利于高效表达异源基因的插入位点三方面对异源蛋白在里氏木霉中的高效表达做了初步研究。此外为了解决里氏木霉同源重组率低、基因同源打靶比较困难的难题，首次在里氏木霉中尝试了不依赖于同源重组的二型内含子介导的基因敲除方法。　　 里氏木霉在表达外源蛋白时，不同的转化株之间因外源基因的拷贝数和插入位点不同，目标蛋白的产量会有很大差别，为了建立一种快速筛选外源基因高效表达高通量筛选方法，本文首次采用来源于口蹄疫病毒的2A序列作为连接肽将红色荧光蛋白报告基因与来源于黑曲霉的异源脂肪酶基因进行融合表达，并用流式细胞仪进行高通量筛选。实验结果表明2A序列两端的蛋白在里氏木霉中可以有效独立地表达，体内红色荧光蛋白的荧光强度和脂肪酶的分泌量呈正相关，报告基因可以很好地表征异源蛋白的产量。　　 为了研究降低里氏木霉外蛋白表达量最大的内源纤维二糖水解酶I(CBH1)是否有助于提高外源基因的表达水平，本义在一株异源表达脂肪酶的里氏木霉菌株N10中，采用RNA干扰的技术手段对其cbh1基因进行负调控，并分别在mRNA和蛋白分泌水平对各干扰菌株中异源脂肪酶和CBH1的表达水平进行分析，结果表明在mRNA水平，与N10菌株相比，各干扰菌株中，cbh1基因的转录水平有了不同程度的降低，而异源脂肪酶基因的mRNA水平并没有明显的差异。SDS-PAGE结果和脂肪酶活性检测的结果均表明在各干扰株中异源脂肪酶的产量有了不同程度的提高，与出发菌株相比，168h发酵液中脂肪酶活性(IU/mL)分别是出发株N10的1.8-3.2倍，而纤维素酶的活性表现出不同程度的降低。说明通过降低CBH1的表达量可以有效提高里氏木霉异源蛋白的产量，而且这种提高发生在翻译及翻译后途径中。　　 基因在基因组中所处的位置对其表达的影响较大，为了研究cbh1基因在里氏木霉基因组中所处的位置对其表达分泌的影响，同时也为了寻找里氏木霉基因组中有利于基因表达的位点，本文在一株cbh1基因缺失的菌株R11的基础上，将cbh1基因进行回复突变，通过分析回复突变菌株中cbh1基因表达量的变化研究插入位点对其表达的影响，实验结果表明，cbh1基因在基因组中所处的位置是其高效分泌表达的重要因素之一。通过对各回复突变株中cbh1基因的拷贝数进行分析，发现在里氏木霉中，基因的插入位点较基因的拷贝数对基因表达的影响更大。该研究还发现了两个较cbh1基因所在的位点更有利于基因表达的新位点。　　 基因敲除是研究基因功能及对宿主进行遗传改造的重要手段，为了解决里氏木霉通过传统的同源打靶进行基因敲除比较困难的问题，本文首次将近年来在原核生物应用比较成熟的不依赖于同源重组的二型内含子介导的基因敲除方法在里氏木霉中做了尝试，虽然实验结果表明所设计的二型内含子并没有在靶基因内部进行有效插入，但所有转化了均表现出相同表型的现象说明二型内含了特异地插入到了基因组中的某个位点。这表明二型内含子介导的基因插入失活方法在真核生物里氏木霉有一定的可行性。本实验虽没有得到预期的结果，但相信随着人们对二型内含子识别DNA插入序列机制的认识不断深入，人工设计插入位点的精确度进一步提高，二型内含子介导的基因敲除手段有望在里氏木霉中得到应用，本研究为在同源重组率极低的里氏木霉中通过基因功能缺失的手段进行遗传改造提供了新的思路。