论文部分内容阅读
背景乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,发病率逐年上升,患者逐渐年轻化,已严重威胁到女性的健康。早诊断、早发现,早治疗,对提高乳腺癌患者的生存率具有重大的意义。CA15-3是乳腺癌常用的肿瘤标志物,但其敏感性不太理想,研究结果显示HE4、CA15-3双联检测,敏感性、准确性均高于单项检测。临床上对HE4、CA15-3进行单项检测方法主要为ECLA,该方法不仅需要价格昂贵的设备及配套的试剂,而且要求专业人员操作,不利于基层医院的推广使用。因此急需建立一种方便、快捷、准确,可在基层医院实现HE4、CA15-3双联检测的方法。目的建立一种HE4、CA15-3时间分辨荧光免疫层析双联检测方法,以期为乳腺癌诊断、预后判断、复发转移预测提供一种技术手段。方法1.用基质血清稀释HE4、CA15-3抗原,罗氏电化学发光法检测试剂进行标定,制备一系列用于HE4、CA15-3荧光免疫层析双联检测的室内参考品。2.HE4、CA15-3荧光免疫层析单项检测方法的建立及组分优化:通过建立HE4、CA15-3荧光免疫层析单项检测方法,筛选配对抗体、硼酸缓冲液的pH值及免疫微球制备过程中复溶后超声时间来优化组分。3.HE4、CA15-3双联检测方法的建立及优化:在HE4、CA15-3荧光免疫层析单项检测方法的基础上,初步建立HE4、CA15-3双联检测的方法。通过对微球垫、NC膜的研究进行原材料的筛选;通过探究检测线的顺序、样品垫处理液、标记抗体量及包被抗体浓度和免疫微球稀释倍数的最优比例、样本检测时间来优化双联检测方法。4.HE4、CA15-3双联检测试纸条性能的评价:对本研究制备的HE4、CA15-3双联检测试纸条的线性范围、最低检出限、特异性、精密性、准确度、以及与罗氏电化学发光法进行方法学比较,来评价试纸条各项性能指标。结果1.制备了的一系列用于HE4、CA15-3荧光免疫层析双联检测的线性、精密性、特异性室内参考品。在-20℃条件下能够稳定保存6个月,满足实验需求。2.建立了HE4、CA15-3荧光免疫层析单项检测方法:筛选出兔IgG多克隆抗体(标记)-33号鼠抗兔IgG单克隆抗体(包被)为质控线最优配对抗体;先后通过CLIA和TRFMIA筛选出PE(标记)-PC(包被)为HE4最优配对抗体,QF(标记)-QE(包被)为CA15-3最优配对抗体。HE4和CA15-3免疫微球制备过程中硼酸缓冲液最适pH值分别是8.0、8.5,并确定了两次离心复溶后超声时间为5 min。3.建立了HE4、CA15-3时间分辨荧光免疫层析双联检测方法:优选“Z80”型号玻璃纤维棉作为微球垫;“CN140(无背衬)”型号的NC膜作包被膜;确定检测线T1包被CA15-3、T2包被HE4;样本垫处理液中T-20的含量为0.25%;HE4、CA15-3单克隆抗体、兔IgG多克隆抗体标记10μL荧光微球时,最佳标记量分别为40μg、30μg、10μg;HE4、CA15-3、鼠抗兔IgG单克隆抗体最佳包被浓度分别为3 mg/mL、2 mg/mL、2 mg/mL;制备HE4、CA15-3单克隆抗体、兔IgG多克隆抗体三种免疫微球时,稀释倍数最优比例为1:1:2;最适检测时间为15 min。4.HE4、CA15-3双联检测试纸条性能的评价:采用log(X)-log(Y)数学模型进行线性回归处理,并拟合线性方程,确定HE4线性范围为15.6-1500 pmol/L,CA15-3线性范围为7.8-500 U/mL;HE4最低检出限为14.33 pmol/L,CA15-3最低检出限为5.00U/mL;同时检测HE4和CA15-3不存在交叉反应,胆红素(5mg/L)、血红蛋白(0.1g/L)、生物素(50 ng/mL)、CA12-5(150 U/mL)、CA19-9(150 U/mL)、CEA(25 ng/mL)对于HE4和CA15-3检测没有干扰,试纸条特异性良好;批内、批间的CV(%)均小于10%,精密性良好;准确度在85%-110%之间,准确性较好;与罗氏电化学发光法检测结果相关性好。结论1、制备了一系列用于HE4、CA15-3时荧光免疫层析双联检测的室内参考品。2、建立了HE4、CA15-3时间分辨荧光免疫层析双联检测方法。