研究背景前列腺癌是欧美国家男性常见的恶性肿瘤,发病率居所有恶性肿瘤的第二位。最新的资料显示,美国2010年前列腺癌新发病例为217730例,占所有肿瘤的28%；2010年美国有32050人死于前列腺癌,占所有因肿瘤死亡者的11%。我国前列腺癌的发病率远低于西方国家,但由于生活方式西化、人口老龄化及前列腺特异抗原(PSA)筛查的普及,近10年来前列腺癌的发病率呈直线上升的态势,前列腺癌的发病率及死亡率显著上升,已成为影响中国男性健康的重要疾病之一,应受到更多的重视。早期局限性前列腺癌一般采用手术或局部放疗,对于晚期前列腺癌,内分泌治疗是多年来公认的有效治疗方法。在内分泌治疗开始阶段,绝大多数患者可以达到肿瘤缩小,血清前列腺特异性抗原(prostate specific antigen, PSA)下降,骨痛减轻,尿路梗阻和出血症状缓解,体力状况改善。但是,相当一部分患者在内分泌治疗中位时间14～30个月后,前列腺癌从对激素依赖逐渐变为对激素不敏感,成为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。CRPC一旦出现,治疗就比较困难,且严重威胁患者的生命。在去势抵抗性前列腺癌中,化疗占有重要的地位。目前,以多西紫杉醇为基础的化疗已经成为一线的化疗方案。紫杉醇类药物的主要作用机制是在G2/M期抑制微管解聚,导致肿瘤细胞有丝分裂障碍,使肿瘤细胞周期阻滞在M期。研究表明,多西紫杉醇在三期实验中对病人生存期有益处,而且能够减少患者疼痛、提高患者的生活质量。多西紫杉醇的主要副作用是嗜中性白血球减少症、骨髓抑制等,这些副作用限制了对老年体弱的晚期前列腺癌患者应用。非常遗憾的是,相当一部分去势抵抗性前列腺癌患者对多西紫杉醇无反应,而且几乎所有的去势抵抗性前列腺癌患者都最终发生药物抵抗。那么找到一种对骨髓抑制小,甚至能升高白细胞的抗肿瘤药物作为辅助或者联合紫杉醇类药物治疗前列腺癌,以减少紫杉醇类药物的副作用,减少其耐药性,可能优化为去势抵抗性前列腺癌的化疗。去甲斑蝥素(Norcantharidin,简称NCTD)是斑蝥素的衍生物,是我国自主研发的抗肿瘤药物,与斑蝥素构型相似,唯1、2位无甲基。去除两个甲基后,NCTD的泌尿系刺激作用基本消失,而且保留了抗癌活性。NCTD目前临床主要用于治疗原发性肝癌、食道癌、胃癌、乙型肝炎以及银屑病等。NCTD的抗肿瘤作用有其独到的优点。研究表明,NCTD相比其他的化疗药物,其骨髓抑制作用较小,而且有升高白细胞的功能。NCTD的这些优点正好弥补多西紫杉醇造成的副作用缺陷。此外,现有研究表明,NCTD的抗肿瘤作用途径的多样性,可能延缓肿瘤耐药的发生,其作用主要有：1、NCTD抑制肿瘤细胞DNA复制,且随着NCTD浓度的增加抑制率逐渐增加；2、NCTD可诱导肿瘤细胞Cdc6蛋白的降解,Cdc6蛋白是起始DNA复制所必须的调节蛋白,NCTD可能通过抑制Cdc6蛋白而抑制肿瘤细胞DNA的复制；3、NCTD可以诱导多种肿瘤细胞凋亡,NCTD诱导肿瘤细胞凋亡的过程中伴有Caspase的活化、Bcl-2和Bcl-xl蛋白的功能调节。近期的研究表明,NCTD诱导肿瘤细胞凋亡受到细胞内MAPK激酶通路的调节,凋亡伴有JNK途径的活化。发现在NCTD诱导的HeLa细胞凋亡过程中ERK和JNK的激活发挥了重要作用。前复制复合体(pre-replication Complex,简称pre-RC)是真核细胞起始DNA复制所必须的调控因子,包括Orc、Cdc6、Cdtl和Mcm2-7,其中Cdc6(cell division cycle6homolog)蛋白具有癌基因的功能,可促进细胞的恶性转化,通过抑制Cdc6可以产生抗肿瘤作用。Cdc6已经被证实可作为有效的抗肿瘤靶点。首先,Cdc6在多种肿瘤组织中高表达,而在正常细胞中表达极低或没有表达,而且其表达与组织的恶性增生进程相关。其次,一些诱导细胞凋亡的因素,如：射线照射、TNF以及一些抗肿瘤药物可抑制Cdc6蛋白。另外,通过RNA干扰的方法抑制Cdc6,可以诱导肿瘤细胞凋亡。有研究结果表明,NCTD可以导致DNA复制起始蛋白Cdc6的裂解。在哺乳动物包括人的细胞中,Cdc6蛋白在两方面发挥功能。一方面,在G1期参与起始DNA的复制。真核细胞DNA复制的起始需要一个被称为“复制前复合体(pre-replication Complex,简称pre-RC)"的组装,即pre-RC中的蛋白组分先后被招募到DNA复制起始位点,一起构成pre-RC后才能起始DNA的复制。在G1期这个“复制前复合体的组装最为重要的一环就是Cdc6与DNA复制起始位点的结合,然后才能启动后续Mcms才能结合于染色体上完成pre-RC的组装。如果Cdc6功能被抑制,细胞将不能完成pre-RC的组装,DNA复制也将受到抑制。另一方面,在S期Cdc6参与调控S-G2/M细胞周期进程。Cdc6通过激活监测点蛋白Chk1而抑制细胞的有丝分裂,确保细胞在S期结束前不会进入M期,协调细胞DNA的复制与有丝分裂的正常进程。Cdc6与前列腺癌：在前列腺癌中,Cdc6参与雄激素受体(AR)的信号转导。雄激素在前列腺癌的发生发展过程中具有重要作用,前列腺癌初期大多表现为雄激素依赖性,但一般经过中位时间(18-24个月)后会转化为去势抵抗性前列腺癌。一旦发展为AIPC其预后较差,此时一般临床使用多西紫杉醇治疗,但往往最终也会产生耐药。近来研究发现,在雄激素依赖性前列腺癌中,雄激素处理会导致Cdc6的高表达,进一步研究证实AR可作为转录因子与cdc6基因启动子结合促进cdc6的转录。Cdc6的高表达可促进前列腺癌的增殖与转移,从而促进前列腺癌的恶性转化。鉴于目前紫杉醇类药物去势抵抗性前列腺癌化疗缺点、Cdc6在细胞周期调控中的重要作用以及Cdc6与前列腺癌的密切关系、前期试验中NCTD能够裂解肿瘤细胞中的Cdc6,NCTD可能成为抗击激素非依赖性前列腺癌的化疗药物,Cdc6可能成为抗击前列腺癌的一个有效靶点。研究目的和方法：本实验共分为4部分：第一部分：探索NCTD是否对激素非依赖的前列腺癌细胞有抗肿瘤作用。目的：检测去甲斑蝥素(NCTD)是否对前列腺癌细胞有抑制作用。方法：MTT试验。将处在指数增长期的前列腺癌细胞株DU145细胞,计数铺板后,加入不同浓度的NCTD作用48h,再加入MTT工作液20gl,放入细胞培养箱继续培养4h,小心吸出上层液体,每孔加入200μIDMSO溶解。测490nm下的吸光度值。每个浓度设置5个复孔,MTT试验重复三次。第二部分：探索NCTD是否能抑制DU145细胞DNA合成及其机制目的：由于真核细胞的分裂增殖前提是DNA的复制合成,在第一部分的实验表面,NCTD能有效抑制DU145细胞的增殖,因此我们探索NCTD是否是通过抑制DNA的复制来产生其抑制作用,并且我们更进一步深入探索在NCTD对复制起始复合物中各个蛋白的影响。1、检测NCTD是否能够抑制DU145细胞DNA合成；2、探索NCTD对DU145细胞复制起始复合物(Pre-RCs)的影响；4、探索NCTD对Pre-RCs的组装的影响。方法：1、BrdU掺入标记试验。BrdU在DNA合成期(S期)可代替胸腺嘧啶,而后利用抗Brdu单克隆抗体,显示DNA复制和细胞增殖情况。将生长良好的DU145细胞接种到载玻片上,放入六孔板中培养,在六孔板中加入或不加入100uM的NCTD,作用24h,然后行BrdU掺入标记试验；2、q-PCR、免疫印迹(WB)：选择生长良好的DU145细胞,以5*1105个/孔铺板,24h后加入不同浓度的NCTD处理,作用48h后,收集细胞提取总RNA,逆转录后做q-PCR,收取其中的蛋白,做western blotting试验,检测在不同浓度NCTD作用48h后,前复制复合体(Pre-RCs)中各个蛋白质组分的含量变化；3、chromatin-binding试验：由于前复制复合体在细胞质中合成,要到细胞核中与染色体结合来发挥其作用,因此我们进一步探索在NCTD作用以后,DU145细胞中的前复制复合体的蛋白与染色体结合的情况,而且为了消除各个细胞处于细胞周期的不同阶段的影响,我们采用细胞同步化的方式,先将细胞用mimosin同步化在G1期,然后选取不同时间点,观察DU145前复制复合体的含量及与染色体结合的情况。细胞首先选取生长良好的DU145细胞,铺板然后进行利用mimosin同步化20h,将细胞同步化在G1期,然后去除mimosin,释放细胞使细胞进入正常的周期进程,在释放之前8h,加入或者不加入NCTD,然后与释放后的0h,3h,6h收集细胞,分离与染色体结合的蛋白和未与染色体结合的蛋白,将这些蛋白样品行western blotting,检测Pre-RCs中各个相关蛋白的含量变化。第三部分：NCTD诱导产生有丝分裂灾变的研究目的：前两部分的实验表面NCTD能够减少DU145细胞中Cdc6的含量,并且能够抑制Cdc6与染色体的结合。由于以往的研究称Cdc6不仅在G1期前复制复合体(Pre-RC)的组装发挥作用,在S期Cdc6参与调控S-G2/M细胞周期进程的调控,以保证细胞在DNA复制完全后进入M期避免有丝分裂灾变(mitotic catastrophe)的发生,而这个进程的调控通路中,Cdc6与ATR的相互作用尤为重要。此部分我们检测NCTD是否能诱导D145细胞发生有丝分裂灾变并通过检测ATR变化和周期的进程,进一步佐证NCTD能够诱导有丝分裂灾变。因此在第三部分实验中,我们检测了在NCTD作用后,即在Cdc6的量以及与染色体结合的发生障碍的情况下,ATR是否也相应地发生了变化,同时通过细胞周期的进程检测NCTD是否能导致ATR相关的检测点通路的作用失效或减弱,并且通过细胞核染色,从形态学上观察了NCTD作用后,打破检测点通路可能出现的有丝分裂灾变的细胞核形态。方法：1、DAPI细胞核染色,DU145细胞在NCTD处理后,用DAPI进行核染色,在显微镜下观察其核象变化,并与对照组对比,统计分析灾变核象；2、ATR的Chromatin binding试验：选取生长良好的DU145细胞铺板,用不同浓度的NCTD处理后,收取细胞,分离与染色体结合蛋白和非结合蛋白,然后分别对Cdc6和ATR行western blotting试验,比较Cdc6和ATR在不同浓度NCTD作用下与对照组的含量变化,重复试验进行统计学处理；3、流式细胞计数(FCM)：本实验用羟基脲(HU)处理DU145细胞,造成DNA复制压力,以此激活ATR检测点通路,在此过程中加入或者不加入NCTD,作用一段时间后,收集细胞检测细胞周期,如果NCTD能够使ATR检测点通路失活,那么在HU和NCTD同时处理的细胞将不会受到ATR检测点通路的约束,从而在DNA未完全复制或者存在DNA损伤的情况下进入有丝分裂期(M期)。第四部分：NCTD与紫杉醇的协同抗肿瘤作用。目的：检测NCTD与紫杉醇(PTX)的联合作用。方法：联合指数(CI值)计算：通过MTT试验分别计算出不同浓度NCTD作用下对DU145细胞的抑制率,计算不同浓度紫杉醇(PTX)对DU145细胞的抑制率,再计算出NCTD与PTX按照一定比例配合(本实验是1：1浓度比)联合作用下对DU145的抑制率,最后将两种药物单独或联合应用的抑制率进行整理,用Calcusyn1软件进行计算。CI＞1表示有药物之间拮抗作用,CI<1表示药物之间有协同作用,CI=1表示药物之间作用是相加的。结果结论：第一部分：结果：浓度为12.5μM,25μM,50μM,100μM,200μM,400μM,800μM的NCTD作用DU145细胞48h后,对细胞的抑制率(均数)分别是0.122,0.144,0.251,0.290,0.587,0.697,0.735；50%的抑制浓度约为200μM。NCTD对DU145细胞生长有强烈的抑制作用,并且随着NCTD浓度的升高抑制效果更明显。结论：NCTD对DU145细胞的有呈剂量依赖的抑制作用,其50%抑制浓度约为200gM第二部分：结果：1、NCTD处理组BrdU阳性所占比例为30%,而对照组的BrdU阳性所占比例约为47%；2、q-PCR结果显示NCTD处理后Cdc6、Mcm2、Mcm6mRNA水平相对于对照组无显著性差异(P>0.05); Mcm3各浓度NCTD处理与对照组相比无显著性差异(图3-3A、B)；Cdc6、Mcm6的蛋白含量处理组相比对照组减少(P＜0.05),并且这种差异随着浓度的升高而加大(图3-3A、B)3、Cdc6与染色体结合的量,在同步化释放后3h和6h后,处理组比对照组明显减少(图3-4A,B)；Mcm2与染色体结合量,在6h时相对于对照组明显减少(图3-4A, C);Mcm6与染色体结合量在0h、6h相对于对照组有明显减少(图3-4A,D)结论：1、NCTD能够抑制DU145细胞的DNA合成；2、NCTD在蛋白水平而非基因减少Pre-RC(前复制复合体)中的组分Cdc6、Mcm6含量；3、在细胞周期的G1期,NCTD能够阻碍Pre-RC的组装,即抑制Cdc6、Mcm2、Mcm6与染色体的结合。第三部分：结果：1、NCTD处理后,DU145细胞出现了有丝分裂灾变(图4-1A)；0μM、50μM、100μM的NCTD处理DU145出现有丝分裂灾变的比例分别是：3%,10%,18%(图4-1B),p<0.05;2、Cdc6的chromatin binding成分和非染色体结合部分都随着NCTD浓度的增大而减少,NCTD处理组与对照组对比有显著差异,p<0.05(图4-2A,B)；对照组中ATR基本没有结合到染色体上(图4-2A,C)；NCTD处理组的染色体上结合了ATR,且ATR与染色体结合的量随着NCTD浓度的升高而降低(图4-2A,C),p<0.05；3、结果如图4-3所示：1、HU组；S期：31.1%,G2/M期：0%,HU导致细胞DNA损伤或复制不全,激活了检测点通路,使细胞不能进入G2/M期；2、HU-NCTD组：S期：23.53%,G2/M期：26.11%,这说明虽然HU导致细胞DNA损伤或复制不全,激活了检测点通路,但是NCTD打破了ATR相关的检测点通路的束缚,细胞仍然异常第进入G2/M期,从而产生异常的有丝分裂,即有丝分裂灾变。结论：1、NCTD能够诱导DU145发生有丝分裂灾变(图4-1)；2、在对照组中ATR未能结合到染色体上,说明ATR的激活需要再DNA受到损伤和复制压力的情况下才会结合到染色体发挥其功能(图4-2)；而随着NCTD浓度的增大,ATR与染色体结合到染色体就越少,说明NCTD能够阻碍ATR与染色体的结合(图4-2),从而阻碍了ATR相关的检测点通路；对ATR与染色体结合的阻断,可能是由于NCTD抑制Cdc6的功能从而无法使ATR结合到染色体上,也可能是NCTD直接对ATR的影响。而NCTD对Cdc6、ATR的影响成为NCTD能够诱导DU145有丝分裂灾变的佐证；3、在HU-NCTD组中相对于HU组,S期的细胞较少,而进入G2/M期的细胞显著增多,说明NCTD可以抑制ATR相关的检测点通路,使细胞异常地进入有丝分裂期,从而诱导有丝分裂灾变。第四部分：结果：在实验浓度范围中CI值<1,NCTD在12.5-400浓度范围内NCTD与PTX有协同抗肿瘤作用。结论：由于NCTD可以从细胞生长周期的不同阶段、不同位点来抑制前列腺癌细胞的生长、诱导其发生凋亡,因此当NCTD与紫杉醇类药物联合运用是有很好的协同抗肿瘤作用。