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第一部分 色素上皮衍生因子PEDF在抑郁障碍中的作用及互作蛋白研究机制
研究背景：
抑郁症是一种常见的精神疾患，主要表现为情绪低落、兴趣缺失、行为绝望和思维迟滞，严重时伴有自杀倾向。目前全球范围内共有3亿人口罹患不同程度的抑郁障碍，给社会和家庭带来巨大的精神和经济压力。过去半个世纪对抑郁症的研究虽然取得了一定了进展，然而对该疾病的评估尚缺乏客观、及时的指标，迄今为止抑郁发病的病理生理机制仍未阐明，且临床现有的抗抑郁药物不能达到满意的疗效需求。
在前期研究中，我们通过临床血浆蛋白质组学技术鉴定，发现色素上皮衍生因子（ Pigment epithelium derived factor ， PEDF ，亦称Serpinf1）在重度抑郁患者血浆内的表达显著下降。我们观察到PEDF在首次发作未用药的重度抑郁患者血浆内表达水平显著低于健康受试者、双向情感障碍及精神分裂症患者，且PEDF在抗抑郁治疗有效的患者血浆内是上调的。在经典的慢性温和型不可预知刺激（ Chronic unpredictable mild stress，CUMS）和慢性社会挫败刺激（Chronic social defeat stress，CSDS）抑郁动物模型的血浆和海马中，PEDF的蛋白水平也显著下调。因此PEDF可作为潜在的诊断抑郁症及判断预后的生物学标志物。然而，目前PEDF作用于抑郁障碍的病因学尚不清楚，其诱导的相关蛋白网络及信号转导通路变化亟待进一步探索。
方法：
本研究分为三部分：第一部分，携带PEDF靶基因Serpinf1的过表达及干扰腺相关病毒侵染鼠脑对宿主精神行为的影响，对其进行形态学、信号转导通路及神经递质的检测；第二部分，基于膜体系酵母双杂交文库的PEDF互作蛋白筛选，蛋白互作网络的构建及PEDF与候选蛋白的互作验证；第三部分， PEDF与候选互作蛋白Grina通过调节NMDA受体活动影响谷氨酸能通路的研究。
主要的方法及技术路线如下：
1. 用携带目的基因Serpinf1的过表达及干扰腺相关病毒对雄性C57BL6小鼠进行海马立体定位注射，检测其在注射后的糖水偏好度、游泳不动时间和悬尾不动时间，了解宿主是否存在精神行为改变。
2. 对异常表达目的基因Serpinf1的小鼠海马进行高尔基染色，了解目的蛋白对海马神经突触的影响。通过Western Blotting了解PEDF对成年小鼠海马Wnt通路信号转导的影响。借助LC-MS靶向神经递质检测技术了解PEDF在海马内引起的神经递质变化。
3. 构建膜体系酵母双杂交脑cDNA文库，以PEDF为诱饵，筛选其在小鼠抑郁和生理情况下的互作蛋白。运用IPA生物信息学技术将筛选出的互作蛋白构建为PEDF在脑内的蛋白互作网络，发掘与之密切相关的生物信号传递通路。通过邻位连接技术及免疫荧光共定位技术确认PEDF与候选蛋白Grina之间的蛋白互作及亚细胞定位。
4. 通过Western Blotting技术检测候选蛋白Grina在抑郁动物模型和PEDF异常表达的小鼠脑内的表达变化，运用qPCR技术探讨PEDF与Grina互作对谷氨酸能通路相关基因的影响。
结果：
1. 在病毒注射后6周，PEDF过表达组(AAV-PEDF)小鼠的糖水偏好度(87.55±1.33%)显著高于过表达对照组(AAV-Veh，78.39±3.95%) ，且前者在强迫游泳中的不动时间(130.27±6.83秒)显著短于过表达对照组(151.29±7.73秒)。与上述结果相反，PEDF干扰组(AAV-shPEDF)小鼠的糖水偏好度(77.90±5.10%)显著低于干扰对照组(AAV-shPEDF ， 98.22±0.56%)及假手术组(Sham，96.64%±0.97%)，且干扰组小鼠在悬尾试验中的不动时间(225.56±8.70 秒)显著长于干扰对照组小鼠(174.21±15.86秒)。
2. 在高尔基染色中， PEDF 过表达组小鼠海马的树突棘数(8.87±0.26)显著多于PEDF干扰组的树突棘数(5.67±0.37)和假手术组的树突棘数(7.00±0.29)，且PEDF干扰组的树突棘数明显少于假手术组。同时，PEDF过表达组的海马树突交叉显著高于PEDF干扰组的交叉数目。
3. PEDF过表达的小鼠海马内BDNF、Axin1、DVL3、pLRP6、activeβ-catenin、SYP、PSD95蛋白水平显著高于过表达对照组，Naked1显著低于过表达对照组。在PEDF干扰组的小鼠海马内，上述指标呈相反趋势。
4. LC-MS靶向神经递质测定提示PEDF干扰组小鼠海马内的谷氨酸水平相较于其对照组小鼠显著降低。
5. 运用膜体系酵母双杂交技术进行筛选，我们共发现小鼠脑内数百个PEDF的互作蛋白。IPA生物信息学技术提示它们主要与蛋白泛素化、GABA受体信号传导、网格蛋白介导的内吞、谷氨酸依赖性酸抵抗、吞噬体成熟、谷氨酸降解、cAMP信号中的多巴胺Darpp32反馈、Wnt/β-catenin通路、eNOS通路和Toll样受体信号相关。
6. 邻位连接技术（Proximity Ligation Assay，PLA）提示PEDF与候选蛋白 NMDA 受体相关蛋白 1 （ N-methyl-D-aspartate associated protein 1，Grina）在鼠脑及BV2细胞内存在互作。免疫荧光技术提示二者主要共定位于细胞膜上。
7. 在CSDS抑郁小鼠模型和干扰PEDF注射的小鼠海马内，PEDF的互作蛋白Grina均显著降低，但在过表达PEDF的小鼠海马内，Grina表达显著上升。
8. RT-qPCR提示，PEDF与Grina在U251细胞系内共同过表达时， NMDAR2A的水平显著高于阴性对照组，但显著低于Grina单独过表达组。PEDF与Grina共同过表达后的谷氨酸脱羧酶GAD1和兴奋性谷氨酸转运体EAAT2的表达水平均显著高于PEDF单独过表达组。
结论：
1. 在体研究发现PEDF对宿主精神行为异常的保护作用，提示PEDF参与调控成年小鼠海马突触生长和 Wnt 信号通路变化，为临床治疗提供潜在靶点。
2. 通过酵母双杂交文库筛选，初步构建了PEDF在脑内的蛋白互作网络，为抑郁症互作脑蛋白网络图谱的绘制及高通量靶点筛选提供前期基础。
3. 举例阐释PEDF与蛋白GRINA互作在抑郁障碍中发挥的作用及内在机制，其可能对维持脑内谷氨酸能通路稳态具有重要意义，这为后续互作蛋白与抑郁症研究提供新思路。
第二部分 酪酸梭菌Miyairi588预防小鼠抑郁障碍的作用机制
背景：
肠道微生物组可能对机体情绪和精神行为产生重大影响。肠道中的有益菌群可能通过微生物-肠-脑轴（Gut-brain axis, MGBA）抑制炎症、降低皮质醇水平来减轻宿主抑郁和焦虑症状。少量报道提示酪酸梭菌可缓解宿主应激时的抑郁障碍，然而其通过微生物-肠-脑轴调控抑郁进程的机制尚不清楚。
方法：
在本文中，我们用商品化的酪酸梭菌（ Clostridium butyricum Miyairi 588, CBM588）预喂养小鼠28天，观察其在慢性社会挫败应激后的行为学变化。用16s测序比较CBM588喂养和清水喂养的CSDS小鼠结肠粪便菌群构成差异。用RT-qPCR验证各组小鼠结肠及海马内炎性因子等的表达。用免疫荧光共定位技术了解不同组别内小鼠脑内小胶质细胞介导的神经炎症反应。
结果：
1. 社会挫败可引起小鼠抑郁样改变，但CBM588预喂养可部分逆转小鼠抑郁样表型，表现为CBM/Stress小鼠较Placebo/Stress小鼠社会交互增多，糖水偏好度增高，游泳不动时间和悬尾不动时间缩短。
2. 16s测序提示，在门水平上，CBM588/Stress小鼠结肠粪便内厚壁杆菌门的丰度显著高于 Placebo/Stress 小鼠组。在科水平上， CBM588/Stress 组粪便内的梭菌科（ Clostridiaceae ）丰度小于Placebo/Stress组, 但CBM588/Stress组梭菌科（Clostridiales vadinBB60 group）的丰度高于Placebo/Stress组。在种水平上，CBM588/Stress组粪便内的毛螺菌（ Lachnospiraceae NK4A136 group ）、柔嫩梭菌(Clostridium leptum group)、同型产乙酸菌（Blautia coccoides）、理研菌(Rikenellaceae RC9 gut group)、疣微菌（Ruminococcaceae NK4A214）、罗斯氏菌（Clostridiales bacterium Roseburia）丰度均高于Placebo/Stress组；但是 CBM588/Stress 组的分节丝状菌(Candidatus Arthromitus sp-SFB-mouse-Japan)和猪长链球菌(Streptococcus hyointestinalis)的丰度低于Placebo/Stress 组。主坐标分析（ Principle coordination analysis, PCoA）提示两组之间微生物物种组成存在显著差异。
3. RT-qPCR提示，CBM588预喂养可减少CSDS小鼠结肠及脑内炎性因子、糖皮质激素受体、盐皮质激素受体释放，促进神经营养因子和紧密连接蛋白生成，伴随结肠短链脂肪酸受体FFAR2和FFAR3表达增多。
4. CSDS后小鼠海马内Iba1及iNOS升高，但CBM588预喂养的CSDS小鼠海马内Iba1及iNOS表达显著少于清水喂养的CSDS小鼠组。
结论：
酪酸梭菌CBM588预喂养可缓解小鼠应激时的抑郁样表型，揭示酪酸梭菌可能参与调控小胶质细胞介导的脑内免疫反应，从而影响抑郁进程。这为临床抑郁症的预防提供了潜在的治疗策略。
研究背景：
抑郁症是一种常见的精神疾患，主要表现为情绪低落、兴趣缺失、行为绝望和思维迟滞，严重时伴有自杀倾向。目前全球范围内共有3亿人口罹患不同程度的抑郁障碍，给社会和家庭带来巨大的精神和经济压力。过去半个世纪对抑郁症的研究虽然取得了一定了进展，然而对该疾病的评估尚缺乏客观、及时的指标，迄今为止抑郁发病的病理生理机制仍未阐明，且临床现有的抗抑郁药物不能达到满意的疗效需求。
在前期研究中，我们通过临床血浆蛋白质组学技术鉴定，发现色素上皮衍生因子（ Pigment epithelium derived factor ， PEDF ，亦称Serpinf1）在重度抑郁患者血浆内的表达显著下降。我们观察到PEDF在首次发作未用药的重度抑郁患者血浆内表达水平显著低于健康受试者、双向情感障碍及精神分裂症患者，且PEDF在抗抑郁治疗有效的患者血浆内是上调的。在经典的慢性温和型不可预知刺激（ Chronic unpredictable mild stress，CUMS）和慢性社会挫败刺激（Chronic social defeat stress，CSDS）抑郁动物模型的血浆和海马中，PEDF的蛋白水平也显著下调。因此PEDF可作为潜在的诊断抑郁症及判断预后的生物学标志物。然而，目前PEDF作用于抑郁障碍的病因学尚不清楚，其诱导的相关蛋白网络及信号转导通路变化亟待进一步探索。
方法：
本研究分为三部分：第一部分，携带PEDF靶基因Serpinf1的过表达及干扰腺相关病毒侵染鼠脑对宿主精神行为的影响，对其进行形态学、信号转导通路及神经递质的检测；第二部分，基于膜体系酵母双杂交文库的PEDF互作蛋白筛选，蛋白互作网络的构建及PEDF与候选蛋白的互作验证；第三部分， PEDF与候选互作蛋白Grina通过调节NMDA受体活动影响谷氨酸能通路的研究。
主要的方法及技术路线如下：
1. 用携带目的基因Serpinf1的过表达及干扰腺相关病毒对雄性C57BL6小鼠进行海马立体定位注射，检测其在注射后的糖水偏好度、游泳不动时间和悬尾不动时间，了解宿主是否存在精神行为改变。
2. 对异常表达目的基因Serpinf1的小鼠海马进行高尔基染色，了解目的蛋白对海马神经突触的影响。通过Western Blotting了解PEDF对成年小鼠海马Wnt通路信号转导的影响。借助LC-MS靶向神经递质检测技术了解PEDF在海马内引起的神经递质变化。
3. 构建膜体系酵母双杂交脑cDNA文库，以PEDF为诱饵，筛选其在小鼠抑郁和生理情况下的互作蛋白。运用IPA生物信息学技术将筛选出的互作蛋白构建为PEDF在脑内的蛋白互作网络，发掘与之密切相关的生物信号传递通路。通过邻位连接技术及免疫荧光共定位技术确认PEDF与候选蛋白Grina之间的蛋白互作及亚细胞定位。
4. 通过Western Blotting技术检测候选蛋白Grina在抑郁动物模型和PEDF异常表达的小鼠脑内的表达变化，运用qPCR技术探讨PEDF与Grina互作对谷氨酸能通路相关基因的影响。
结果：
1. 在病毒注射后6周，PEDF过表达组(AAV-PEDF)小鼠的糖水偏好度(87.55±1.33%)显著高于过表达对照组(AAV-Veh，78.39±3.95%) ，且前者在强迫游泳中的不动时间(130.27±6.83秒)显著短于过表达对照组(151.29±7.73秒)。与上述结果相反，PEDF干扰组(AAV-shPEDF)小鼠的糖水偏好度(77.90±5.10%)显著低于干扰对照组(AAV-shPEDF ， 98.22±0.56%)及假手术组(Sham，96.64%±0.97%)，且干扰组小鼠在悬尾试验中的不动时间(225.56±8.70 秒)显著长于干扰对照组小鼠(174.21±15.86秒)。
2. 在高尔基染色中， PEDF 过表达组小鼠海马的树突棘数(8.87±0.26)显著多于PEDF干扰组的树突棘数(5.67±0.37)和假手术组的树突棘数(7.00±0.29)，且PEDF干扰组的树突棘数明显少于假手术组。同时，PEDF过表达组的海马树突交叉显著高于PEDF干扰组的交叉数目。
3. PEDF过表达的小鼠海马内BDNF、Axin1、DVL3、pLRP6、activeβ-catenin、SYP、PSD95蛋白水平显著高于过表达对照组，Naked1显著低于过表达对照组。在PEDF干扰组的小鼠海马内，上述指标呈相反趋势。
4. LC-MS靶向神经递质测定提示PEDF干扰组小鼠海马内的谷氨酸水平相较于其对照组小鼠显著降低。
5. 运用膜体系酵母双杂交技术进行筛选，我们共发现小鼠脑内数百个PEDF的互作蛋白。IPA生物信息学技术提示它们主要与蛋白泛素化、GABA受体信号传导、网格蛋白介导的内吞、谷氨酸依赖性酸抵抗、吞噬体成熟、谷氨酸降解、cAMP信号中的多巴胺Darpp32反馈、Wnt/β-catenin通路、eNOS通路和Toll样受体信号相关。
6. 邻位连接技术（Proximity Ligation Assay，PLA）提示PEDF与候选蛋白 NMDA 受体相关蛋白 1 （ N-methyl-D-aspartate associated protein 1，Grina）在鼠脑及BV2细胞内存在互作。免疫荧光技术提示二者主要共定位于细胞膜上。
7. 在CSDS抑郁小鼠模型和干扰PEDF注射的小鼠海马内，PEDF的互作蛋白Grina均显著降低，但在过表达PEDF的小鼠海马内，Grina表达显著上升。
8. RT-qPCR提示，PEDF与Grina在U251细胞系内共同过表达时， NMDAR2A的水平显著高于阴性对照组，但显著低于Grina单独过表达组。PEDF与Grina共同过表达后的谷氨酸脱羧酶GAD1和兴奋性谷氨酸转运体EAAT2的表达水平均显著高于PEDF单独过表达组。
结论：
1. 在体研究发现PEDF对宿主精神行为异常的保护作用，提示PEDF参与调控成年小鼠海马突触生长和 Wnt 信号通路变化，为临床治疗提供潜在靶点。
2. 通过酵母双杂交文库筛选，初步构建了PEDF在脑内的蛋白互作网络，为抑郁症互作脑蛋白网络图谱的绘制及高通量靶点筛选提供前期基础。
3. 举例阐释PEDF与蛋白GRINA互作在抑郁障碍中发挥的作用及内在机制，其可能对维持脑内谷氨酸能通路稳态具有重要意义，这为后续互作蛋白与抑郁症研究提供新思路。
第二部分 酪酸梭菌Miyairi588预防小鼠抑郁障碍的作用机制
背景：
肠道微生物组可能对机体情绪和精神行为产生重大影响。肠道中的有益菌群可能通过微生物-肠-脑轴（Gut-brain axis, MGBA）抑制炎症、降低皮质醇水平来减轻宿主抑郁和焦虑症状。少量报道提示酪酸梭菌可缓解宿主应激时的抑郁障碍，然而其通过微生物-肠-脑轴调控抑郁进程的机制尚不清楚。
方法：
在本文中，我们用商品化的酪酸梭菌（ Clostridium butyricum Miyairi 588, CBM588）预喂养小鼠28天，观察其在慢性社会挫败应激后的行为学变化。用16s测序比较CBM588喂养和清水喂养的CSDS小鼠结肠粪便菌群构成差异。用RT-qPCR验证各组小鼠结肠及海马内炎性因子等的表达。用免疫荧光共定位技术了解不同组别内小鼠脑内小胶质细胞介导的神经炎症反应。
结果：
1. 社会挫败可引起小鼠抑郁样改变，但CBM588预喂养可部分逆转小鼠抑郁样表型，表现为CBM/Stress小鼠较Placebo/Stress小鼠社会交互增多，糖水偏好度增高，游泳不动时间和悬尾不动时间缩短。
2. 16s测序提示，在门水平上，CBM588/Stress小鼠结肠粪便内厚壁杆菌门的丰度显著高于 Placebo/Stress 小鼠组。在科水平上， CBM588/Stress 组粪便内的梭菌科（ Clostridiaceae ）丰度小于Placebo/Stress组, 但CBM588/Stress组梭菌科（Clostridiales vadinBB60 group）的丰度高于Placebo/Stress组。在种水平上，CBM588/Stress组粪便内的毛螺菌（ Lachnospiraceae NK4A136 group ）、柔嫩梭菌(Clostridium leptum group)、同型产乙酸菌（Blautia coccoides）、理研菌(Rikenellaceae RC9 gut group)、疣微菌（Ruminococcaceae NK4A214）、罗斯氏菌（Clostridiales bacterium Roseburia）丰度均高于Placebo/Stress组；但是 CBM588/Stress 组的分节丝状菌(Candidatus Arthromitus sp-SFB-mouse-Japan)和猪长链球菌(Streptococcus hyointestinalis)的丰度低于Placebo/Stress 组。主坐标分析（ Principle coordination analysis, PCoA）提示两组之间微生物物种组成存在显著差异。
3. RT-qPCR提示，CBM588预喂养可减少CSDS小鼠结肠及脑内炎性因子、糖皮质激素受体、盐皮质激素受体释放，促进神经营养因子和紧密连接蛋白生成，伴随结肠短链脂肪酸受体FFAR2和FFAR3表达增多。
4. CSDS后小鼠海马内Iba1及iNOS升高，但CBM588预喂养的CSDS小鼠海马内Iba1及iNOS表达显著少于清水喂养的CSDS小鼠组。
结论：
酪酸梭菌CBM588预喂养可缓解小鼠应激时的抑郁样表型，揭示酪酸梭菌可能参与调控小胶质细胞介导的脑内免疫反应，从而影响抑郁进程。这为临床抑郁症的预防提供了潜在的治疗策略。