目的 构建含绿色荧光蛋白（GFP）标记、β-连环蛋白（β-catenin）特异的RNAi重组腺病毒表达载体,利用包装好的重组腺病毒感染羊膜间充质干细胞（AMSC）,在转录后水平有效的抑制β-catenin的表达,探讨siRNA干扰(β-catenin对AMSC增殖的影响。 方法 利用脂质体将设计合成好的三个β-catenin siRNA干扰片段瞬时转染AMSC,利用免疫印迹（Western Blot）筛选最优的β-catenin siRNA干扰片段；然后编码针对最优干扰片段,即CTNNB1短发卡RNA （short hairpin RNA, shRNA）的单链DNA,并通过退火反应获得目的基因双链DNA,将目的基因连接至腺病毒穿梭质粒中构建阳性重组质粒pAdTrack-si-β-catenin,经PmeI酶切线性化后使其在BJ5183菌中与腺病毒骨架质粒进行同源重组从而获得重组腺病毒载体pAd-si-β-catenin,利用脂质体将经Pac I酶切线性化后的重组腺病毒质粒转染至HEK293细胞,包装重组腺病毒、空斑实验测定病毒滴度。重组腺病毒感染AMSC, Western Blot法检测AMSC中β-catenin及GSK-3β的表达情况,CKK-8法检测β-catenin沉默表达对AMSC增殖的影响。 结果 1. β-catenin siRNA干扰片段瞬时转染AMSC可以有效抑制β-catenin的表达,通过Western Blot成功的筛选出了最优的目的基因靶序列,设计并合成了shRNA的DNA双链,并成功构建出重组腺病毒表达载体p Ad-si-β-catenin;成功的包装、扩增出重组腺病毒,获得高滴度重组腺病毒。 2.重组腺病毒感染AMSC后,在荧光倒置显微镜下可以观察到GFP表达,通过Western Blot检测到重组腺病毒感染AMSC后可以有效的抑制β-catenin基因的表达,感染组β-catenin明显少于对照组。 3.重组腺病毒感染AMSC后,通过CKK-8法检测细胞生长曲线,与对照组相比,感染组细胞的增殖受到明显抑制。 结论 构建的特异RNAi重组腺病毒能够有效的抑制β-catenin基因的表达,减少了细胞内β-catenin的水平,且β-catenin的沉默表达可以明显抑制AMSC的增殖。