卡那霉素A和卡那霉素B是野生卡那链霉菌的次级代谢产物,都属于2-DOS类氨基糖苷类抗生素,是广谱类抗生素,对革兰氏阴性菌具有显著的杀菌效果,得到广泛的临床使用。近些年,耐药菌种类的激增给AGAs的临床使用造成阻碍,而且较强的毒副作用也进一步限制着它们的临床使用。为了解决这类问题,人们一方面通过对其进行官能团的改造来削减其毒副作用;另一方面也通过半合成等方法来开发越来越多的新型氨基糖苷抗生素。其中一个很典型的案例就是以卡那霉素B为原料合成地贝卡星和阿贝卡星。本课题组在以卡那霉素B为原料半合成阿贝卡星的工作方面已经有完善的体系,但是作为卡那链霉菌的次级代谢产物,卡那霉素B产量不足总产量的10%,远不能满足作为工业生产阿贝卡星的原料,这也使得这类药物价格昂贵。因此通过分析卡那链霉菌合成生物学信息,对其关键酶基因进行改造来实现卡那霉素B的富产,降低阿贝卡星生产成本。实验中通过研究卡那霉素生物合成基因簇,确定了导致卡那霉素B产量低下的原因是由于两个关键酶基因kanF和kanJ的作用,其中kanF基因编码一种可以同时选择两种糖基供体的糖基转移酶,造成了卡那霉素双平行合成路线的上游分支;kanJ基因编码的酶催化卡那霉素B向卡那霉素A转化的第一步反应。据此分别利用基因工程的方法设计了实验改造两种基因来构建富产卡那霉素B的工程菌株。针对上游kanF基因,首先构建了neo8表达质粒并完成了neo8在卡那链霉菌中的异源表达,使其卡那霉素B的产量相比野生卡那链霉菌提高了2.1倍,并且改变了发酵液中卡那霉素A和B的占比,从原先的卡那霉素B仅为卡那霉素A的5.7%提高到了18.2%,为卡那霉素B的富产提供条件。并在此基础上成功构建了neo8-kan 重组质粒,摸索出了多个大片段目的基因与原始质粒的连接方法,确立了 pKC1139这类温敏型质粒在卡那链霉菌中的接合转移体系。除此之外还建立了PermE*+neo 表达体系,尝试验证红霉素启动子PermE*在卡那链霉菌中的作用,为后续卡那霉素合成基因簇的异源表达奠定基础。针对下游kanJ基因,成功构建了kan 敲除变株,使工程菌株的卡那霉素B发酵产量浓度达到661.0mg·L-1,相比于原始亲株,提高了 200倍以上;也比实验室早期工作中通过诱变育种的方法构建富产卡那霉素B的方法提高了约5.5倍。而且改变了发酵产物产量分配,使卡那霉素B成为发酵液中的主要产物,平均产量是卡那霉素A的10.5倍。