杜兴肌肉萎缩症(Duchenne Muscular Dystrophy-DMD),是一种由于DMD基因突变而引起的伴X染色体连锁的隐性遗传病,临床表现为全身肌肉进行性萎缩。随着医疗手段的发展,DMD骨骼肌的治疗取得了突破性的进展,但对心肌肥大失调缺乏有效的治疗手段,而心肌肥大失调引起的心脏功能衰竭是DMD致死的主要原因。临床数据显示:DMD病人的心脏外膜纤维化严重,并且出现收缩功能异常。而WT1~+细胞是一类定位于心脏外膜,具有多向分化潜能的细胞,其激活与分化对心脏损伤和重塑具有调控作用。在心肌缺血再灌注及其他心脏疾病模型的研究结果显示:WT1~+细胞对血管再生及改善心脏功能起重要作用,但WT1~+细胞是否对DMD心肌肥大失调具有调控作用,还有待研究。基于此,本研究拟探讨心外膜WT1~+细胞与DMD心脏功能的相关性;并阐释心外膜WT1~+细胞对DMD心脏纤维化的作用机制,以期为DMD心肌肥大失调治疗提供新靶点。本研究利用两种DMD小鼠模型包括老龄mdx小鼠和端粒酶敲除mdx小鼠。在两种DMD小鼠模型上,通过心外膜WT1~+细胞与心脏功能相关性分析发现:在两种DMD小鼠心脏中WT1~+细胞数量显著增加,但小鼠心脏功能却显著恶化;病理特征为纤维化严重,表明WT1~+细胞的异常激活可能与心脏纤维化及功能恶化存在相关性。为进一步明确心外膜WT1~+细胞异常激活与DMD心脏纤维化的关系,本研究通过体内外实验示踪心外膜WT1~+细胞的定位、分布和分化潜能变化。研究结果表明:在DMD心脏中,心外膜WT1~+细胞与成纤维细胞共定位,但未发现与平滑肌细胞或血管内皮细胞的共定位,说明WT1~+细胞异常激活后,主要向成纤维细胞分化,进而导致DMD心脏纤维化和功能恶化。为进一步验证WT1~+细胞对DMD心脏功能的调控作用,我们选用心外膜WT1~+细胞的激活剂-胸腺肽Tβ4,以放大心外膜WT1~+细胞对DMD心脏功能的调控效应。通过在两种不同的DMD小鼠模型-端粒酶敲除mdx小鼠和阿霉素损伤的mdx小鼠上,对胸腺肽Tβ4的系统测试。结果发现:Tβ4给药组小鼠心外膜WT1~+细胞的显著增多,但心脏纤维化却明显下降,而且心脏功能显著改善,说明Tβ4对心外膜WT1~+细胞的激活,可能与DMD小鼠病理条件下的激活调控机制不同。为进一步阐明Tβ4对心外膜WT1~+细胞激活及分化潜能的调控作用,本研究利用体内外模型,来研究Tβ4对DMD小鼠心外膜WT1~+细胞激活与分化潜能的影响。在端粒酶敲除mdx小鼠上研究结果表明:Tβ4治疗组的心外膜WT1~+细胞与成纤维细胞的共定位减少,而与平滑肌共定位增加,说明Tβ4能够调控WT1~+细胞的分化潜能。同时,Tβ4治疗组心脏纤维化的面积显著减少,功能显著提高,说明Tβ4通过改变DMD病理条件下心外膜WT1~+细胞的分化趋向和潜能,进而达到改善DMD心脏功能的作用。在此基础上,在端粒酶敲除mdx小鼠来源的原代心外膜细胞上再次证实Tβ4调控心外膜WT1~+细胞分化潜能的作用。此外,据临床数据显示:与正常人相比,DMD病人心肌细胞呈现明显的DNA损伤。为检测Tβ4是否对DMD病理条件下的DNA损伤具有保护作用,本研究对Tβ4治疗组心脏的DNA损伤进行检测。结果显示:Tβ4显著降低DNA损伤相关蛋白的表达,说明其对DNA损伤具有保护作用。而且,对Tβ4治疗组小鼠骨骼肌的检测发现,Tβ4能够提高小鼠抓力,减少肌肉纤维化,说明Tβ4能够显著改善DMD小鼠骨骼肌病理及功能。为验证Tβ4的临床适用性,本研究检测临床DMD病人血清中Tβ4的含量,结果发现:与正常人相比,DMD病人中血清Tβ4含量显著降低,表明Tβ4可作为DMD治疗候选药物。总而言之,本研究首次揭示心外膜WT1~+细胞异常激活和分化促进DMD心脏纤维化及功能恶化;而Tβ4可通过逆转DMD病理条件下WT1~+细胞的分化潜能,进而改善心脏病理和功能。本研究结果为DMD心肌肥大失调的治疗提供了新靶点及新型候选药物。针对DMD心肌肥大失调治疗研究中,缺乏合适的体外模型,在本研究中,利用成年小鼠心脏外植体获取并建立了心肌球源性干细胞系。通过对其增殖能力、染色体稳定性、基因表达谱和体外分化潜能等系统鉴定,证实所建立的细胞系为心肌球源性干细胞,为DMD心肌肥大失调及其他心脏相关疾病的治疗研究提供了体外测试模型。