研究背景随着核辐射在工业、医疗、军事等领域的广泛应用,人们在享受电离辐射、核能带来的诸多便利的同时,也增加了受照的风险,辐射安全越来越受到学界及公众的关注。免疫系统对辐射非常敏感,电离辐射照射早期,大量的免疫细胞凋亡,免疫器官结构严重受损,照后很长一段时间,免疫功能仍然维持低下。研究辐射对免疫系统的损伤效应及其分子机制,开发安全有效的防治策略,对保护电离辐射对免疫系统的损伤意义重大。以往的辐射免疫学研究主要集中在辐射敏感的T、B淋巴细胞等方面,对发现较晚的树突状细胞(Dendritic Cells,DC)研究较少,这方面尚属空白。随着对DC功能作用的研究深入,发现它们是最重要的抗原提呈细胞,是连接固有免疫和获得性免疫的桥梁,在抗感染、抗肿瘤和免疫调节中具有十分重要的作用。DC多以未成熟的状态存在,平时定居在外周组织,当受到外界刺激时,DC经血液循环到达感染部位,摄取抗原并迁移至位于二级淋巴器官的T细胞区。而DC迅速、准确的迁移到T细胞区是其发挥抗原呈递功能、激活获得性免疫的前提。此外,DC具有多种亚型,分别分布在机体的不同部位,发挥各自的免疫学功能。利用细胞活力分析、细胞凋亡等观察手段发现,DC与其淋巴细胞相比具有较强的辐射抗性。但是,受照后活存的DC细胞功能有无损伤、亚型有无变化,在照后机体免疫功能恢复中起到什么作用未见深入研究。本研究中,我们探索辐射对DC迁移功能及其亚型的影响,以及它们在放射损伤中的作用,这对揭示辐射对免疫系统的影响的具体机制,开发新型的辐射防治手段具有重要意义。另一方面,免疫系统辐射损伤的防护一直是辐射防护领域重要难题之一。其主要原因一是细胞辐射敏感性分子机制尚未彻底阐明,难以找到防护研究所需的特异性分子靶点,二是多年研究未解决高效、无毒副作用医学防护措施的难题。所以,有必要从揭示细胞辐射敏感性分子机制和寻找高效、无毒副作用化合物等多角度开展研究。研究细胞辐射敏感性的分子机制,对理解不同免疫细胞之间的辐射抗性的区别,筛选辐射抗性相关基因,开发特异性辐射防治手段具有重要意义。本研究中我们筛选了辐射诱导WRN磷酸化的位点S1141,并对其功能及其在辐射损伤中作用进行了研究,初步探讨了WRN蛋白S1141位点磷酸化在细胞辐射敏感性中的作用机制。在免疫系统辐射损伤防护研究方面,本项目传承了我们教研室分子氢辐射防护作用的研究思路,在分子氢对整体动物的辐射防护作用,对造血系统、雄性生殖系统、消化系统等均具有很好的辐射防护作用的研究基础上,探讨分子氢对免疫系统的辐射防护作用,发现分子氢不仅对?射线照射导致的免疫系统的损伤具有很好的防护效果,对空间重离子12C6+照射导致的免疫细胞损伤,也起到很好的保护作用。研究内容:一、全身照射后DC迁移功能的变化1.全身照射对表皮及真皮DC密度和DC迁移功能的影响2.全身照射对皮肤组织中趋化因子和炎症因子表达水平的影响3.NF-k B在辐射诱导皮肤DC迁移中的分子机理探讨二、全身照射后DC亚型的变化及其在放射病中的作用1.全身照射后小鼠DC亚型的比例和分布的变化2.肿瘤放疗患者外周血中各亚型DC比例的变化3.全身照射对CD8+DC和CD8-DC的分布、凋亡和分化的影响4.CD8+DC和CD8-DC变化在辐射导致的Th1/Th2平衡中的作用三、分子氢对免疫系统辐射损伤的防护作用1.分子氢对γ射线全身照射后胸腺和脾脏细胞的防护作用2.分子氢对γ射线照后血象的保护作用3.分子氢对重离子辐射导致的免疫细胞损伤的防护作用4.分子氢对辐射诱导的羟自由基和ROS的清除作用5.分子氢对照后凋亡分子caspase 3的影响四、WRN蛋白S1141位点磷酸化在细胞辐射损伤中的作用1.辐射导致的WRN蛋白的磷酸化位点S1141的鉴定2.WRN蛋白S1141位点磷酸化对细胞辐射损伤效应的影响3.WRN蛋白S1141位点磷酸化在基因组稳定性维持中的作用4.WRN蛋白S1141位点磷酸化在照后DNA损伤反应中的作用5.ATM在辐射诱导WRN蛋白S1141位点磷酸化中的作用研究方法1.γ射线和重离子照射DC辐射损伤部分和分子氢防护γ射线损伤部分均使用我校辐照中心Co-60辐照源进行照射;重离子辐射防护部分使用中国科学院近代物理研究所重离子大型辐照装置进行照射;WRN蛋白磷酸化部分在美国德克萨斯大学西南医学中心用Cs-137辐射源进行照射。2.实验动物和细胞DC部分实验使用C57BL/6小鼠;分子氢防护免疫系统损伤部分使用Balb/c小鼠,使用人淋巴母细胞AHH-1细胞;WRN实验部分使用SV-40永生化的WS患者的细胞。3.FITC过敏反应诱导的皮肤DC的迁移根据文献方法,使用含有FITC的丙酮和二丁酯诱导的过敏反应模型,促进皮肤DC向淋巴结的迁移,在淋巴结收集CD11c+的DC,若同时具有FITC着色,则表明是由皮肤迁移过来的。4.皮肤表皮分离与真皮切片将鼠耳摘除,分离其背侧面和腹侧面,将腹侧面放在EDTA溶液中孵育,破坏表皮与真皮之间的连接。然后用注射器针头轻轻剥离,得到表皮用于免疫荧光染色。皮肤组织用OCT包埋后,进行冰冻切片。5.免疫荧光染色将鼠耳或做好的冰冻切片,用多聚甲醛固定,然后通过封闭,抗体孵育等步骤,进行染色,最后用DAPI进行细胞核染色并封片,镜下观察,拍照。6.流式细胞仪分析对于各亚型的DC,用带有不同荧光素的抗体标记,然后上流式细胞仪检测,最后用分析软件,分析各群细胞的比例。7.CCL19诱导的组织DC的迁移摘除鼠耳,将其背侧面与腹侧面分离,然后将背侧面放在培养基中培养4小时,以去除非迁移的细胞,然后放在含有趋化因子CCL19的培养基中培养,收集迁移的细胞,用流式计数。8.实时荧光定量PCR取皮肤或淋巴结组织,提取总RNA,进行反转录PCR,然后用Realtime PCR反应,得到各组反应的CT值,计算每个基因表达倍数的变化。9.蛋白样品制备使用含有蛋白酶和蛋白激酶的抑制剂的RIPA裂解液,匀浆裂解组织,或裂解细胞,得到细胞或组织总蛋白;核蛋白提取:使用核蛋白提取试剂盒提取组织核蛋白。10.Western blotting检测蛋白表达情况提取蛋白后,使用BCA蛋白浓度试剂盒测量各组蛋白的浓度,然后根据蛋白浓度上样,进行SDS电泳,转膜,封闭,抗体孵育,显影等,检测蛋白表达水平的变化。11.小鼠BMDC诱导培养无菌取股骨,用无菌培养基冲出骨髓细胞,用Tris-NH4Cl破红后,在含有GM-CSF和IL-4的RMPI1640培养基中刺激培养48小时,轻轻吹打吸去悬浮细胞,继续培养至第5天,收集悬浮细胞,换为正常的RMPI1640培养基即为BMDC。12.富氢溶液培养基制备将高纯度氢气充入装有培养基或生理盐水的袋中,使用高气压设备,在0.4MPa的气压下放置4小时,然后缓慢减压,待将为常压时取出,保存以备使用。13.羟自由基检测在照射前向培养基中加入HPF羟自由基探针,孵育AHH-1细胞,照后立即离心收集细胞,取载玻片制作细胞涂片,用荧光显微镜拍照,分析荧光强度,计算羟自由基水平。14.小鼠血常规检测使用小动物血常规检测分析仪检测小鼠血象变化。15.caspase 3活性检测使用小鼠Caspase 3活性检测试剂盒检测小鼠脾脏匀浆液中caspase 3活性的变化,通过检测各孔的A405吸光值,结合标准曲线计算caspase 3的活性。16.活性氧水平检测本研究使用活性氧检测试剂盒检测照后AHH-1细胞内活性氧的水平,用DCFH-DA探针孵育细胞一段时间后照射,用流式细胞仪分析平均荧光强度,计算细胞内活性氧相对水平的变化。17.细胞凋亡检测使用Annexin V细胞凋亡试剂盒用流式细胞仪分析照后免疫细胞的凋亡;使用TUNEL染色法标记细胞原位凋亡情况。另外,用Hoechst染色法,计算凋亡率。18.WRN突变型细胞系构建在永生化WS细胞的基础上,转染WT-WRN和1141A突变-WRN,1141D突变WRN,建立稳筛细胞系,得到WT,1141A和1141D细胞。19.克隆形成率实验将各组细胞按照不同数目种于细胞培养皿中,给予不同剂量照射,将细胞培养7-14天,注意观察克隆生长情况,最后用含有甲醇的吉姆萨染液染色,统计克隆形成情况,计算克隆形成率。20.细胞周期分析收集细胞,PBS清洗后,用冰乙醇固定,然后用Rnase处理去除RNA,用PI对DNA进行染色,流式细胞仪分析细胞周期;对于M期细胞周期分析,参照免疫荧光染色方法,用p H3抗体染色,再结合PI染色方法,用流式细胞仪分析细胞周期变化。21.免疫共沉淀(IP)提取细胞总蛋白后,加入Flag抗体和Protein A的珠子,孵育过夜,然后离心珠子,并清洗,获得Flag特异性结合的蛋白。进行SDS电泳实验。研究结果一、全身照射后DC迁移功能的变化1.全身照射导致表皮及真皮DC数目减少发现亚致死剂量(6Gy)全身照射后,表皮树突状细胞密度明显降低,于第三天达到最低,之后有所恢复;发现照后腹股沟淋巴结内DC比例明显增高。我们研究了真皮中DC的数目变化,发现2Gy照射后变化不明显,但4Gy、6Gy照射后,真皮DC数目明显减少,说明辐射促进了皮肤DC的迁移。2.辐射促进小鼠耳朵DC向趋化因子CCL19迁移发现2Gy,4Gy照射后,48小时内,培养基中DC的数目明显增多,说明辐射促进了培养基中的鼠耳DC向CCL19的迁移。3.辐射对小鼠皮肤组织CCR7和CCR19的m RNA表达的影响发现6Gy照后2小时、4小时,皮肤组织中CCR7的m RNA表达量明显上调,8小时接近正常水平。而照后2-8小时皮肤和淋巴结中的CCL19和CCL21的表达都呈现上调趋势,同时,辐射导致的CCL19,CCL21的表达也具有明显的剂量依赖性。4.全身照射后皮肤炎性因子表达的变化发现6Gy照射明显上调皮肤中TNF-α,IL-1α,IL-1β,IL-6等的表达,这些细胞因子均参加DC的激活;4Gy照射可明显上调TNF-α,IL-1α,IL-6等的表达,辐射导致细胞因子的表达在一定范围内呈现剂量依赖的趋势。5.全身照射激活NF-k B信号分子发现辐射对总NF-k B p65没有明显影响,但可以明显诱导p65的核转位,增加其在细胞核中的表达水平。6.NF-k B抑制剂PDTC减轻辐射导致的皮肤DC密度的下降PDTC是NF-k B的抑制剂。发现6Gyγ射线照射后第三天,单纯照射组DC密度下降明显;50mg/kg和100mg/kg PDTC注射组,DC密度有所下降,但高于单纯照射组;100mg/ml PDTC组几乎接近单纯对照水平。二、全身照射后DC亚型的变化及其在放射病中的作用1.全身照射导致小鼠脾脏DC亚型的变化γ射线全身照射之后,C57BL/6小鼠CD11c+MHC2+DC比例明显增加,于第三天达到峰值,照后一个月,基本恢复到正常水平;照后CD8+DC比例明显下降,CD8+DC与CD8-DC的比值大幅下降呈现剂量依赖性,于照后第三天达到最低。2.全身照射导致Th1免疫反应减弱而Th2反应增强发现脾脏切片IFN-?阳性细胞比例明显减少,而IL-4阳性细胞的比例增加,说明照后发生了Th1向Th2的偏移。通过检测转录因子Tbet和Gata3的表达变化,发现照后Tbet表达下降,而Gata3表达增加,提示Th1和Th2反应的变化。3.辐射不导致CD8+DC和CD8-DC的调亡通过在体照射、离体照射和原位凋亡等方法检测,均发现辐射对CD8+DC和CD8-DC的细胞凋亡没有明显影响。4.全身照射对DC分化的影响照后小鼠骨髓细胞分化成CD11c+DC的能力变强,而分化成CD8+DC的比例明显减少。我们还检测了CD8+DC和CD8-DC分化相关的转录因子IRF8,IRF4,BATF3以及CD8+DC分化相关细胞因子FLT3,发现照后IRF4和IRF8表达均下调。5.辐照后CD8+DC来源的IL-12表达水平降低照射后脾脏组织IL-12的m RNA表达水平明显下降,于第10天有所恢复。6.FLT3配体减轻辐射导致的CD8+DC和CD8-DC失衡和Th1/Th2的失衡FLT3配体减少了照后CD11c+MHC2+DC的比例,FLT3处理后,CD8+DC和CD8-DC的比例失衡得到改善,Tbet和Gata3的比例也有所增加7.肿瘤放疗患者外周血中各型DC亚型比例的变化我们发现和未放疗的患者相比,总HLA-DR+Lin-DC的比例增高,这与我们小鼠的研究相似。另外我们发现照后与小鼠CD8+DC同源的人BDCA3+DC有所下降,具有统计学意义。三、分子氢对γ射线和重离子照射导致的免疫系统辐射损伤的防护作用1.分子氢减轻γ射线照射后胸腺和脾脏细胞的凋亡水平照前腹腔注射富氢盐水,可以有效减少γ射线导致的胸腺和脾脏细胞的凋亡。2.分子氢对γ射线照射后血象的保护作用分子氢显著提高外周血白细胞和血小板的数目,而对其余血常规指标没有明显影响。3.分子氢降低12C6+重离子辐射导致的淋巴细胞凋亡重离子辐照明显导致AHH-1细胞的凋亡,氢水组凋亡明显降低。4.分子氢减轻12C6+重离子辐射诱导的细胞周期阻滞12C6+重离子(1,2Gy)照射可以导致明显的G2/M细胞周期阻滞,富氢盐水处理组,阻滞情况得以改善。5.分子氢降低γ射线和重离子辐射诱导的羟自由基和ROS水平使用HPF荧光探针检测了分子氢对γ射线(8Gy)照后AHH-1细胞中的羟自由基水平的影响,发现和正常培养基相比,富氢培养基孵育可以明显减少照后细胞内羟自由基的水平;分子氢处理有效减少了重离子照射细胞里羟自由基的水平,降低了总ROS活性,我们还发现,和普通生理盐水相比,氢水中羟自由基的含量明显降低。6.分子氢抑制γ射线和重离子辐射激活caspase 3ELISA结果显示,γ射线照射后,caspase 3活性明显增加,加氢组明显降低。重离子辐射导致c-caspase 3的激活,在观察范围内具有剂量依赖性,而相比于相同剂量照射组,在照射+H2组c-caspase 3的表达明显降低。四、WRN蛋白S1141位点磷酸化在细胞辐射损伤中的作用1.照后WRN蛋白的磷酸化位点鉴定收集照射和未照射的Hela细胞,提取并纯化WRN蛋白。将纯化的WRN蛋白进行质谱分析,比较两组的差异,得到WRN的磷酸化位点“S1141”。2.辐照后WRN蛋白磷酸化变化情况发现不同剂量辐射明显诱导WRN蛋白S1141位点磷酸化,具有明显的剂量依赖性。又研究了照后不同时间S1141磷酸化的影响,发现照后30分钟达到最强,因此在后续实验中,我们选择了10Gy照射后30分钟作为辐射导致WRN蛋白磷酸化的检测观察点。3.辐射导致的S1141位点磷酸化是ATM依赖的发现Hela细胞10Gy照射后30分钟,S1141位点已发生磷酸化,而在3μM,10μM ATM抑制剂(KU55933)处理组,WRN磷酸化明显减弱,且10μM抑制效果更明显。DNA-PKcs抑制剂可抑制DNA-PKcs S2056位点的磷酸化,但对WRN蛋白磷酸化没有影响。这一现象在ATM-/-和DNA-PKcs-/-细胞中得到证实。4.WRN蛋白S1141位点突变细胞系的建立我们在WS患者永生化细胞(WS细胞)的基础上构建了WS+野生型WRN(WT细胞),WS+1141丙氨酸(A)突变型WRN(1141A细胞),WS+1141天冬氨酸(D)突变型(1141D细胞),经Western blot检测,细胞系构建成功。5.WRN蛋白S1141位点突变对辐射敏感型的影响发现相比于WT细胞,WS细胞和1141A细胞辐射敏感性有所增加,有统计学差异。而1141D细胞的辐射敏感性明显降低。6.WRN蛋白S1141位点磷酸化在辐射导致细胞周期阻滞中的作用在WS和WRN蛋白S1141位点A突变型细胞中,照后G2/M阻滞更明显,照后4小时已很明显,12小时达到峰值,但16小时甚至24小时后,细胞周期阻滞仍难以恢复;然后我们检测了p H3阳性细胞的变化,发现在WS和1141A突变型细胞中,照后M期细胞迅速减少,恢复明显减慢。7.照后DNA损伤反应通路蛋白的变化我们检测了G2细胞周期调控的关键通路:ATM-Chk2通路和p53-p21-cdc2通路相关蛋白的表达和磷酸化水平的变化,发现在三种细胞中辐射可诱导ATM及其下游分子磷酸化,无明显区别;但我们发现在WS和1141A细胞中,辐射可以明显诱导p53的激活。8.WRN蛋白S1141位点磷酸化在基因组稳定性维持中的作用在WS和WRN的S1141A突变型细胞里,辐射导致明显的染色体畸变,畸变率高于WT细胞,但在A突变型细胞内低于WS细胞。分析讨论免疫系统的辐射敏感性较高,中等剂量的电离辐射即可导致免疫系统的严重损伤,且恢复困难。本研究探讨了电离辐射照射后DC表型及功能的变化及初步的机制;本研究探讨了分子氢对γ射线和重离子辐射导致的免疫系统损伤的防护效应;最后以WRN蛋白磷酸化在细胞辐射敏感性中的作用研究为切入点,探讨了辐射导致的细胞损伤的分子机制。DC是最重要的抗原提呈细胞,在免疫反应中发挥核心调节作用,而关于辐射对DC影响的研究较少。之前有研究报道局部照射促进DC迁移,而我们的研究显示照射体外培养的DC可以抑制DC的迁移,本研究我们明确了全身照射可以促进外周DC向淋巴结的迁移,并从炎症因子、趋化因子和NF-k B信号通路激活的角度,揭示了全身照射对皮肤DC迁移功能的影响的初步机制,阐释了NF-k B在这一过程中的关键作用。另外,本研究首次探讨了辐射对DC亚型的影响,发现辐射可以导致CD8+和CD8-DC的失衡,并且导致Th1和Th2免疫反应的失衡。由于CD8+DC主要诱导Th1免疫反应,CD8-DC主要诱导Th2反应,随后我们一方面,从迁移和再分布、凋亡、分化等角度探讨了辐射导致CD8+DC和CD8-DC失衡的机制;另一方面,我们探讨了这CD8+DC和CD8-DC比例下降对于Th1/Th2免疫平衡的影响。初步寻找了IL-12可能是介导CD8+DC和Th1反应之间的重要因子。发现FLT3配体对调控这两型DC的恢复方面有重要作用,同时,我们的发现也在人外周血中得到验证。这为辐射导致的免疫抑制提出了新的思路。为了进一步了解免疫系统辐射损伤的分子机制,并开发高效、低毒的辐射防护手段,我们一方面探讨了分子氢的辐射防护效果,发现分子氢很好的保护了γ射线和重离子照射导致的免疫系统损伤。关于γ射线辐射生物学研究较多,亚致死剂量γ射线照射过的小鼠第一天到第三天,脾脏和胸腺等免疫器官迅速缩小,免疫细胞大量凋亡或释放入血。重离子辐射属于高LET辐射,常见于空间辐射、核电站泄露等情况,主要特点是射线电离能力强,传递能量大等特点,生物效能较大。我们发现分子氢可以明显减少γ射线和重离子照射导致的细胞凋亡,细胞周期紊乱等。目前认为其机制与抗氧化应激、清除自由基有关。近期的研究表明,分子氢可能是作为信号分子而发挥作用,并发现它对LPS/IFNc,JNK和NFк-B等信号通路具有调节作用,我们也发现分子氢处理后,caspase 3的活性明显减弱。另一方面,我们以WRN蛋白磷酸化为切入点探讨了细胞辐射损伤的分子机制,筛选出辐射诱导的WRN蛋白S1141磷酸化,并发现S1141A突变型细胞发生了明显的G2周期阻滞。首先我们发现辐射导致的WRN蛋白S1141位点磷酸化主要依赖于ATM的表达和磷酸化,而不依赖DNA-PKcs。然后我们从细胞辐射敏感性、细胞周期调节、DNA损伤修复通路等方面探讨了WRN蛋白S1141位点磷酸化在辐射损伤中的作用。发现这一位点的失活型突变细胞1141A细胞,辐射敏感性有所提高,细胞周期阻滞明显,难以恢复。然后我们发现WRN蛋白S1141位点磷酸化水平并不影响ATM及其底物KAP1的磷酸化,但p53总量明显高于WT细胞,且照后p53磷酸化水平迅速增加,并不随时间降低,这与我们细胞周期的变化趋势一致。这些结果说明p53在辐射导致的WS和1141A细胞周期阻滞中可能发挥重要调控作用但深入机制还需要继续探讨。总之,本研究发现全身照射促进皮肤DC向淋巴结的迁移,导致小鼠CD8+DC和CD8-DC亚型失衡,并发现其可能与Th1/Th2偏移有关。通过研究分子氢对免疫细胞的辐射防护作用,我们发现其对不同LET射线照射的损伤,都具有很好的辐射防护作用,并对其作用机制做了初步探讨。为了更深入的了解辐射导致细胞损伤的分子机制,我们探讨并发现了WRN蛋白S1141位点磷酸化在照后细胞周期阻滞的恢复中具有关键作用。本研究为明确免疫系统的辐射损伤效应及其分子机制,寻找安全、有效的免疫系统防治药物提供了数据支持。