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二氢杨梅素(Dihydromyricetin,DMY)是一种黄酮类化合物。它具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、消炎等多种功效,且是保肝护肝、解酒醒酒的良品。但是,二氢杨梅素的脂溶性较差,不易被人体的肝脏有效吸收,将其酰化成二氢杨梅素酯,可提高它被肝脏的利用效率。酶促二氢杨梅素酰化因其高效、绿色、反应条件温和、区域选择性高等优点而已引起人们的广泛关注。本文通过筛选得到一种脂肪酶(黑曲霉脂肪酶,Aspergillus niger lipase,ANL),其能有效地催化二氢杨梅素酰化,但是游离脂肪酶容易失活、难以重复回收利用的特点限制了其进一步在工业上的应用。因此,对ANL进行固定化能够很好地解决以上问题,产生重大的经济效益和社会效益。近年来,磁性四氧化三铁纳米粒子(MNPs)由于其超顺磁性、比表面积高、生物相容性好、低毒性等性质引起了研究人员广泛关注,然而,磁性四氧化三铁纳米粒子需要被表面修饰才能进一步被用作酶固定化的载体。受海洋生物贻贝粘附作用启发而制备的仿生材料聚多巴胺(polydopamine,PDA)制备过程简单温和,且聚多巴胺的表面含有酚羟基等具有高反应活性的基团可以进行二次反应,PDA越来越多地被应用在有机和无机材料表面的修饰中。本论文采用碱共沉淀法合成了MNPs,并利用多巴胺单体在类似海水的碱性(pH=8.5)条件下的自聚合作用在MNPs表面形成一层聚多巴胺层,从而得到聚多巴胺包裹的磁性四氧化三铁纳米粒子(PD-MNPs),通过对PD-MNPs进行了结构表征,结果表明MNPs的尺寸在10 nm左右,表面PDA层的厚度在4 nm左右,PD-MNPs具有良好的耐热性和超顺磁性,晶型仍然和MNPs一样。然后,以制备的PD-MNPs作为ANL的酶载体,利用聚多巴胺表层中的活性基团与含有氨基和巯基的ANL分子发生迈克尔加成或者席夫碱反应,将ANL固定在PD-MNPs表面,制备得到一种带有磁性的、高活性的、高稳定性的新型纳米级酶制剂ANL@PD-MNPs。并且探讨了不同pH、固定化时间对ANL@PD-MNPs酶活回收率的影响,结果表明在载体/酶质量比为4.8:1,固定化pH为8.0,固定化时间为12 h的条件下,酶的负载量为138 mg/g时,酶活回收率达到83.6%。系统研究了新型纳米级酶制剂ANL@PD-MNPs的酶学性质,并利用傅立叶红外光谱仪(FTIR)对游离ANL和ANL@PD-MNPs进行了二级结构分析。通过二级结构分析发现,固定化酶ANL@PD-MNPs二级结构中的α-螺旋和β-折叠含量相比于游离anl分别增加了2.74%、0.84%,结果表明anl经过固定化后,其结构刚性和稳定性均有所增强;固定化酶anl@pd-mnps最适ph为8.0,最适温度为40°c,同时,anl@pd-mnps酶活性构象结构的刚性得到增强,其耐受性(热稳定性、ph稳定性、溶剂稳定性)均要优于游离anl;此外,固定化酶anl@pd-mnps在4°c条件下储藏20d后,仍有92.8%的相对酶活回收率,远高于游离anl。酶反应动力学研究表明,游离anl的vmax/km值为4.07?10-4min-1,而anl@pd-mnps相应的vmax/km值为3.73?10-4min-1,anl@pd-mnps的底物亲和能力变强,酶活性中心更易与底物发生接触,在同等条件下其具有更强的催化能力。酶学性质研究表明,anl固定在pd-mnps后,其稳定性和催化活性均有所提高。研究了有机溶剂中anl@pd-mnps催化dmy酰化的反应。在所选择的酰基供体中,仅有乙酸乙烯酯在anl@pd-mnps催化作用下与dmy发生酰化反应,所得产物经过ms和nmr鉴定为二氢杨梅素-16-乙酸酯。固定化酶anl@pd-mnps催化该dmy乙酰化反应的最适底物摩尔比为(乙酸乙烯酯/dmy)10:1,最适温度为40°c,最适酶添加量为60u。在上述最适条件下,反应初速度和转化率分别为7.1mm/h、83.1%。在重复利用10次后,anl@pd-mnps相对活性仍超过55%,并且其区域选择性未受到影响。为了进一步提高固定化酶anl@pd-mnps催化dmy酰化反应效率,采用含深度共熔溶剂(des)的混合体系作为该反应介质。结果表明,在chcl:glycerol-dmso(1:3)混合溶剂中,anl@pd-mnps能够高效催化dmy与乙酸乙烯酯发生乙酰化反应,生成二氢杨梅素-16-乙酸酯。该反应的最适底物摩尔比为(乙酸乙烯酯/dmy)10:1,最适温度为45°c,最适酶添加量为50u。当底物浓度高达300mm时,该反应在chcl:glycerol-dmso(1:3)混合溶剂中反应初速度为55.2mm/h,反应24h后,转化率为85.3%;而在dmso中,反应初速度为34.9mm/h,反应48h后,转化率为78.8%。可见,在含des的混合溶剂中anl@pd-mnps催化dmy酰化反应效率明显提高了。dmy经过酰化后,其脂溶性增加,达到了0.635gdmy-16-乙酸酯/100g油,比dmy的溶解度几乎增加了10倍。此外,分离纯化dmy乙酰化产物,并对其抗氧化性进行了初步评价。二氢杨梅素-16-乙酸酯清除dpph自由基的ic50为4.16mg/ml、清除羟基自由基的ic50为1.79mg/ml、螯合fe2+的ic50为0.13mg/ml,表明二氢杨梅素-16-乙酸酯具有良好的抗氧化性。本论文首次研究了聚多巴胺包裹的磁性四氧化三铁纳米材料固定化黑曲霉及其高效催化二氢杨梅素酰化反应的研究。该新型纳米级酶制剂制备过程简单,能在磁场作用下实现酶与反应介质的迅速分离,具有酶载量高、酶活高、稳定性高的特点,并且能够有效催化二氢杨梅素酰化。该研究有助于丰富酶的国定化技术,深化对酶-载体相互作用的认识,所建立的生物催化体系可用于其它黄酮类物质的生物改性。