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目的:探讨DADS对肿瘤细胞生物学行为的抑制效应,研究DJ-1高表达对DADS抑制MGC803细胞EMT与迁移侵袭的影响,阐明DJ-1在胃癌中的作用,进而证实DJ-1是DADS抑制人胃癌细胞迁移与侵袭的作用靶点之一,为临床胃癌分子靶向治疗提供理论依据。方法:针对DJ-1基因构建DJ-1高表达质粒,借助于脂质体转染至胃癌MGC803细胞系,经G418筛选8周后,建立DJ-1高表达的MGC803细胞稳转株,并采用Western blot、q RT-PCR方法检测转染至MGC803细胞中DJ-1蛋白和mRNA的表达水平,验证DJ-1的转染效率。对DADS处理前后的各组MGC803细胞系的相关生物学行为进行比较,验证高表达DJ-1与DADS对MGC803细胞相关生物学行为的影响。相差显微镜观察各组MGC803细胞形态的改变;MTT和平皿克隆检测DADS对MGC803细胞增殖的抑制作用;细胞迁移实验、划痕实验与细胞侵袭实验检测MGC803细胞的迁延与侵袭能力的变化情况;细胞免疫荧光、Western blots及qRT-PCR检测MGC803细胞中DJ-1、PTEN、AKT、p-AKT、Vimentin、E-Cadherin、MMP-9、TIMP-3、Snail mRNA和蛋白表达的变化;裸鼠成瘤实验观察DADS对裸鼠体内MGC803细胞成瘤能力的影响。结果:1.成功构建稳定DJ-1高表达的MGC803细胞株。将DJ-1高表达质粒及空载体质粒分别转染至人胃癌MGC803细胞,使用Western blot、q RT-PCR方法验证转染MGC803细胞内DJ-1表达显著升高,转染成功。之后,再用G418对转染细胞进行筛选,最终建立稳定DJ-1高表达MGC803细胞株。2.相差显微镜观察各组MGC803细胞的形态改变相差显微镜显示,MGC803细胞呈长梭形,异型性明显。DJ-1高表达MGC803细胞较前者细胞形态长梭形更显著。DADS处理24h后,MGC803细胞梭形减少,椭圆形增多,异型性下降。DADS处理后的DJ-1高表达细胞部分变圆形,梭形细胞减少。3.DADS与DJ-1高表达对MGC803细胞增殖的影响平皿克隆实验结果显示DADS处理后MGC803细胞与DJ-1高表达组细胞克隆形成数分别为27.7±1.15、34.7±1.53,与未处理MGC803及DJ-1高表达组克隆形成45.3±2.08、86.3±1.53比较明显减少(P<0.05)。表明DJ-1高表达能促进MGC803细胞的增殖,而DADS能抑制MGC803细胞增殖。4.DADS与DJ-1高表达对MGC803细胞迁移与侵袭的影响迁移实验显示,MGC803组和空载体组24h后迁移细胞数为116±1.22与127±1.58无显著性差异(P>0.05)。DJ-1高表达组24h后迁移细胞数175.4±1.67显著高于MGC803及空载体组(P<0.05)。DADS处理24h后,MGC803组和空载体组迁移细胞为56±1.58与76.8±1.64较未处理组明显减少(P<0.05);DJ-1高表达组迁移细胞124±1.58较前两者细胞迁移细胞仍然增多,而较未处理组明显减少(P<0.05)。划痕实验显示,24h后,DJ-1高表达组细胞迁移距离30.74±7.14较MGC803组13.77±4.33和空载体组14.98±3.17明显增加(P<0.05)。DADS作用24h后,DJ-1高表达组迁移距离12.78±1.96较处理前明显缩短(P<0.05),MGC803组9.60±1.82与空载体组9.74±0.69较处理前显著减少(P<0.05)。表明DJ-1高表达能促进MGC803细胞的迁移能力,而减弱DADS对MGC803细胞迁移力的抑制作用。侵袭实验显示,MGC803组和空载体组24h后穿膜细胞数为67.4±1.14与62.8±2.77,无显著差异(P>0.05);DJ-1高表达组24h后穿膜细胞86.6±1.52显著高于MGC803及空载体组(P<0.05)。DADS处理后,MGC803组、空载体组与DJ-1高表达组穿膜细胞分别为54.2±1.92,50.2±1.64与55.4±1.52,较处理前穿膜数目明显减少(P<0.05)。表明DJ-1高表达能促进MGC803细胞的侵袭,而DADS可抑制MGC803细胞侵袭。5.DADS对各组MGC803细胞DJ-1/PTEN/p-Akt表达的影响qRT-PCR结果显示,空载体组细胞DJ-1 mRNA表达水平与MGC803细胞组无显著差异,而DJ-1高表达MGC803细胞与MGC803细胞相比,DJ-1 mRNA表达显著上调,PTEN mRNA表达下调(P<0.05)。DADS处理后,各处理组较未处理组DJ-1 mRNA下调,PTEN mRNA表达上调(P<0.05)。Western blot显示,MGC803组与空载体组相比较,DJ-1蛋白表达水平两者无统计学差异(P>0.05)。而DJ-1高表达细胞较MGC803细胞DJ-1表达显著上调(P<0.05)。DADS处理后,MGC803细胞、空载体组与DJ-1高表达细胞的DJ-1及p-Akt的表达较未处理组下调,而PTEN表达增加(P<0.05)。而处理前后各组细胞内AKT蛋白的表达水平未发生显著改变。表明DADS可下调DJ-1、p-Akt蛋白与上调PTEN。结果与qRT-PCR结果一致。细胞免疫荧光显示,DJ-1高表达细胞中,DJ-1荧光明显增强,而PTEN显著降低。DADS处理后较未处理组DJ-1荧光强度明显下降,PTEN荧光明显增加。结果与qRT-PCR、Western Blot结果一致。6.DADS对MGC803细胞EMT相关标志物的影响qRT-PCR结果显示,DJ-1高表达细胞较MGC803细胞Vimentin、MMP-9、Snail mRNA表达显著上调,而E-cadherin mRNA下调(P<0.05)。DADS处理各组较未处理组Vimentin、MMP-9、Snail mRNA表达下调,E-cadherin mRNA表达增加(P<0.05)。表明DADS下调DJ-1可抑制MGC803细胞EMT。Western blot显示,DJ-1高表达较MGC803细胞Vimentin、MMP-9与Snail蛋白表达显著上调,E-cadherin蛋白表达下调(P<0.05)。而DADS处理后各组Vimentin、MMP-9与Snail蛋白表达较未处理组降低,而E-cadherin蛋白表达上调(P<0.05)。免疫荧光显示,DJ-1高表达细胞较MGC803细胞与空载体细胞Vimentin、MMP-9蛋白荧光明显增强,而E-cadherin荧光显著降低。DADS处理后较未处理组Vimentin、MMP-9的荧光强度明显下降,E-cadherin荧光明显增加。结果与qRT-PCR、Western Blot结果一致。7.DADS与DJ-1高表达对MGC803细胞成瘤能力的影响裸鼠成瘤结果显示,DJ-1高表达组较MGC803细胞组移植瘤的体积与重量显著增加(P<0.05)。而DADS处理后DJ-1高表达组与MGC803细胞组移植瘤的体积与重量显著降低(P<0.05)。表明DJ-1高表达可促进MGC803细胞裸鼠的成瘤能力,而DADS可明显抑制裸鼠的成瘤能力。结论:1.DJ-1高表达可促进MGC803细胞的增殖、EMT与迁移侵袭及成瘤能力。2.DADS可通过阻断DJ-1/PTEN/AKT通路抑制MGC803细胞增殖、EMT与迁移侵袭及成瘤能力。