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口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是一种烈性传染病,由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起,发病急,传播方式多样。注射疫苗仍是现阶段防控口蹄疫的有效措施。因单独的灭活口蹄疫病毒大多免疫原性低,急需合适的佐剂提升其免疫效力。P97作为猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）纤毛粘附因子,诱导以黏膜免疫和细胞免疫为主的免疫应答。鞭毛蛋白（Flagellin,F）是天然免疫应答的诱导剂,以偶联或融合形式作为佐剂已被频繁报道。霍乱毒素B亚基（Cholera toxin B subunit,CTB）具有良好免疫佐剂活性,黏膜途径免疫其效果更佳。本研究以P97、F7-CTB为佐剂,与口蹄疫灭活病毒或口蹄疫灭活疫苗混合的形式免疫接种小鼠及猪,通过检测特异性Ig G抗体、Ig A抗体滴度、脾脏淋巴细胞亚型比例和细胞因子的表达,评估对疫苗的免疫增强效力,以期筛选针对FMD疫苗的良好佐剂。主要研究内容分为以下4部分:1、猪肺炎支原体纤毛粘附因子P97对O型口蹄疫灭活疫苗免疫增强的研究将pET32a-P97-R1重组质粒转化至Trans5α感受态细胞,提取的质粒经限制性内切酶消化,测序正确后将目的质粒再转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,体外诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE分析,重组蛋白分子量为26.5k D,证明重组P97获得成功表达。将25只6周龄的Balb/c小鼠随机分为5组,分别接种PBS、口蹄疫灭活疫苗、P97+口蹄疫灭活疫苗、灭活FMDV、和P97+灭活FMDV以评价它们诱导免疫应答的能力。结果显示:经过2次免疫后,相比PBS阴性对照组,所有免疫组Ig G均有不同程度的升高。其中,P97试验组与相应对照组略有差异;Ig A抗体:除PBS组外,其余组别都有上升。首免21d,P97+灭活FMDV是灭活FMDV的4倍。随后持续升高;脾脏淋巴细胞CD3+CD4+和CD3+CD8+比例:P97试验组及相应对照组的CD3+CD4+淋巴细胞比值略高于PBS阴性对照,而在CD3+CD8+变化上,试验组均略低于对照组0.03%-1%不等;细胞因子的表达水平:含P97的试验组在干扰素（Interferon,IFN）-γ表达水平上与相应对照组处于持平或略低的状态。检测白介素（Interleukin,IL）-4含量,P97+灭活FMDV为53.75pg/ml,其略高于灭活FMDV（50.93pg/ml）。测定的肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）-α浓度,除PBS组外,4个免疫组差异最大仅有9.36ng/L。本次试验表明,Mhp纤毛黏附因子P97在诱导Ig G、Ig A、CD3+CD4+/CD3+CD8+亚型比例和IFN-γ、IL-4、TNF-α表达水平上,免疫增强效力较弱。2、F7-CTB对O型口蹄疫灭活疫苗免疫增强作用的研究酶切消化前期构建的pCold-I-F7和pUC57-CTB重组质粒,后将T4 DNA ligase连接的产物转化Trans5α感受态细胞,通过酶切及测序双重鉴定正确后,得到重组质粒p Cold I-F7-CTB。转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,进行诱导表达,SDS-PAGE显示,分子量为74.65 k D,证明重组F7-CTB获得成功表达。将25只6周龄的Balb/c小鼠随机分为5组,皮下注射。即PBS、灭活FMDV、F7-CTB+灭活FMDV、口蹄疫灭活疫苗和F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗免疫组,评价F7-CTB诱导免疫应答的能力。结果为:从Ig G滴度看,除PBS对照组外,剩余试验组抗体都有产生。首免35d,P97+灭活FMDV是灭活FMDV的10.42倍（P<0.01）,首免49d,为5倍（P<0.05）,仍保持优势。间接ELISA测得粪便中Ig A,相比PBS对照组,4个免疫组存在不同程度的升高,且在首免35d达到最高值。首免35d,F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗滴度是口蹄疫灭活疫苗的3.17倍。流式细胞仪检测后,发现比PBS组,其余各组CD3+CD4+淋巴细胞比例上升0.07%-0.57%不等。脾脏淋巴细胞CD3+CD8+比例,4个免疫组相对PBS阴性对照组小幅降低0.03%-1.23%。测定细胞因子水平,IFN-γ和TNF-α的浓度在免疫组别间最大差异仅是136.23ng/L和1.58ng/L。而P97+灭活FMDV的IL-4含量为55.54pg/ml,略高于灭活FMDV。本次试验表明,F7-CTB能更好地促进Ig G应答,且具有较弱的诱导Ig A、CD3+CD4+/CD3+CD8+亚型比例和IFN-γ、IL-4、TNF-α表达水平的作用。3、猪肺炎支原体纤毛粘附因子P97和F7-CTB对O型口蹄疫灭活疫苗免疫增强效果的研究将30只6周龄的Balb/c小鼠随机分为6组,即皮下途径免疫:P97+口蹄疫灭活疫苗、F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗和P97+F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗免疫组;腹腔途径免疫:P97+口蹄疫灭活疫苗PBS、F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗和P97+F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗免疫组。经2次免疫,评估不同免疫途径对体液免疫应答的影响,及皮下免疫途径组别两种重组蛋白免疫应答的联合作用。结果:首免35d和49d,P97+口蹄疫灭活疫苗的皮下注射途径显著高于对应腹腔免疫途径组（P<0.05）。亦有F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗及P97+F7-CTB+口蹄疫灭活疫苗皮下免疫途径比腹腔途径Ig G抗体滴度分别高216和1318.5（P<0.05）,因此后续试验研究皮下接种组别。首免35d,P97+F7-CTB试验组Ig G抗体是P97试验组的3.26倍（P<0.05）;首免49d,P97+F7-CTB试验组是F7-CTB试验组的2.86倍（P<0.05）。Ig A水平在首免49d,P97免疫组、F7-CTB免疫组和联合应用组别存在一定的协同作用。脾脏淋巴细胞亚型比例显示,3个免疫组的CD3+CD4+差别在1.47%-5.33%,CD3+CD8+差别最大在2%。细胞因子表达的浓度:免疫组IFN-γ、IL-4和TNF-α的表达浓度差别最大分别为49.99ng/L、3.54pg/ml和2.7ng/L。本次试验表明,P97及F7-CTB联合应用皮下途径能更好地促进Ig G应答,在诱导Ig A、CD3+CD4+/CD3+CD8+亚型比例和IFN-γ、IL-4、TNF-α表达水平的作用较弱。4、猪肺炎支原体纤毛粘附因子P97和F7-CTB联合应用增强FMDV疫苗猪体免疫效果的研究将10头FMDV抗体检测呈阴性的60日龄猪,随机分为2组,即P97（125μg）+F7-CTB（125μg）+商品化灭活疫苗和商品化灭活疫苗。肌肉注射,免疫1次,首免后第30d采血,检测血清中Ig G和Ig A。结果:在首免30d,P97（125μg）+F7-CTB（125μg）+商品化灭活疫苗产生较高的Ig G水平,4/5头猪达到99%保护状态;商品化灭活疫苗组平均Ig G抗体滴度略低于P97（125μg）+F7-CTB（125μg）+商品化灭活疫苗,1/5处于99%保护,但两组差异不显著（P>0.05）。Ig A抗体:商品化灭活疫苗只能产生少量的Ig A抗体,而P97（125μg）+F7-CTB（125μg）+商品化灭活疫苗产生高水平的Ig A（P<0.05）。综上所述,F7-CTB在小鼠FMD特异性IgG水平上可显著增强。而佐剂P97和F7-CTB具有协同作用,通过皮下途径免疫,大幅提高FMD特异性Ig G水平,Ig A存在小幅升高,CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞比值和IFN-γ、IL-4、TNF-α表达增强幅度较弱,显示其具有良好的应用前景。由此推测,佐剂P97和F7-CTB的联合应用可能在小鼠和猪体内能有效地促进FMDV诱导的体液免疫应答,某种程度上加强对猪的免疫保护,其中还能增强猪体的黏膜免疫应答。本研究P97和F7-CTB的协同作用,为FMDV疫苗新型疫苗猪的研制提供新的思路。