【摘 要】
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脂修饰是一类广泛存在的蛋白翻译后修饰,由于脂质分子独特的物理化学性质赋予了蛋白质特殊的结构和功能,因此开展蛋白质翻译脂修饰结构与功能的分析对于细胞交叉调控信号转导通路等机制研究具有重要的意义。研究表明哺乳动物体内脂修饰的来源多数是内源性活化的长链脂酰辅酶A。但是目前针对长链脂酰辅酶A这类重要的调控脂修饰反应的辅助因子,其相应的检测技术极度匮乏,所以开发新型的检测技术迫在眉睫。荧光蛋白目前被广泛应用
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脂修饰是一类广泛存在的蛋白翻译后修饰,由于脂质分子独特的物理化学性质赋予了蛋白质特殊的结构和功能,因此开展蛋白质翻译脂修饰结构与功能的分析对于细胞交叉调控信号转导通路等机制研究具有重要的意义。研究表明哺乳动物体内脂修饰的来源多数是内源性活化的长链脂酰辅酶A。但是目前针对长链脂酰辅酶A这类重要的调控脂修饰反应的辅助因子,其相应的检测技术极度匮乏,所以开发新型的检测技术迫在眉睫。荧光蛋白目前被广泛应用于体内蛋白的标记,由于这些荧光蛋白完全由基因编码组成,因此它们也被称为遗传编码荧光探针。由于荧光蛋白探针作为一种天然蛋白探针,相对于化学小分子荧光探针,遗传编码的荧光蛋白探针在精确定位亚细胞结构、消除人为干扰以及活体应用方面存在显著的优势。因此基于荧光蛋白的探针成像成为近年来生命科学和医学领域迅速发展的一种分析检测技术,目前已经被广泛地应用于活细胞内各类生理过程的实时观测。基于上述理论,本课题研究的关键和重心是针对长链脂酰辅酶A发展快速、空间特异性和实时动态的荧光蛋白探针技术。随后将该技术应用于多种肿瘤细胞和正常细胞内长链脂酰辅酶A的监测,希望可以鉴定出长链脂酰辅酶A含量存在的细微差别,同时实现在单细胞和活体动物水平对长链脂酰辅酶A的高时空分辨检测和成像。详细研究内容如下:1.以PyBOP作缩合剂进行脂肪酸与辅酶A的缩合,共合成了 11个短、中、长链脂酰辅酶A。通过外源添加脂酰辅酶A,筛选出荧光响应强、配体特异性好的长链脂酰辅酶A荧光蛋白探针。2.通过分子克隆技术将荧光蛋白（cpYFP）插入长链脂酰辅酶A特异性结合蛋白（FadR）的特定关键位置,经过定点突变和荧光蛋白linker优化等方法,共构建了 63个荧光蛋白探针。体外表征结果表明,以荧光蛋白插入位点H91以及linker为SAG/GT和R/R的两种探针,对长链脂酰辅酶A具有纳摩尔水平的亲和力和较强的荧光变化,命名为AcylCoASer 1和AcylCoASer 2。3.利用脂质体转染方法将AcylCoASer 1和AcylCoASer 2分别转染至HEK293T细胞中进行细胞成像。在长链脂酰辅酶A合成酶抑制剂N-乙基马来酰亚胺处理HEK293T细胞后,AcylCoASer 1随着时间的增加荧光增强,AcylCoASer 2随着时间增加荧光减弱。结果表明,两类探针可以检测细胞内长链脂酰辅酶A的动态变化。4.本研究开发的这类可遗传编码的AcylCoASer探针具有在肿瘤细胞内对长链脂酰辅酶A检测的能力。该探针的发现也将为更好地研究肿瘤内的长链脂修饰蛋白的调控机制,提供重要的创新工具。
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