目的：沙门菌质粒毒力基因spv（Salmonella plasmid virulence genes）与细菌毒力表型密切相关。本实验以携带spv基因的鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium，S.typhimurium）野生株和突变株为受试菌，通过优化电转化条件构建荧光素酶标记的发光菌株。构建沙门菌感染的细胞模型和实验动物模型，研究该基因在体内外对细胞自噬及感染过程的影响，为后续深入研究沙门菌致病机制及探索细胞自噬分子机制提供理论和实验依据，并为实时动态追踪沙门菌的感染过程提供有效的工具和手段。方法：一、鼠伤寒沙门菌生物发光菌株的构建为研究影响电转化效率的因素，选用不同感受态细菌培养时间、培养基、感受态细胞浓度、电击参数和质粒浓度等条件，以小分子质粒pDMT-GFP电转化受试菌，通过计算转化效率确定优化的电转条件。在此基础上用携带荧光素酶基因的大分子质粒pBEN276电转化spv基因野生株S. typhimurium χ3306和spv基因突变株S. typhimurium UF110。成功获得转化子后以阿拉伯糖诱导重组，经生物发光检测筛选稳定发光菌株，获得野生株和突变株的发光菌χ3306lux和UF110lux。连续传代12d，每3d检测一定数量细菌的生物发光强度，以确定生物发光的稳定性。梯度稀释发光菌菌液，检测生物发光强度，计算菌量和发光强度的关系。二、沙门菌质粒毒力基因spv对HeLa细胞自噬的影响1.以携带spv基因的鼠伤寒沙门菌野生株χ3306lux和突变株UF110lux与稳定转染了带有红色和绿色荧光蛋白标记微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associatedprotein1light chain3，LC3）（mRFP-GFP-LC3）的HeLa细胞体外共培养，制备细胞感染模型，以未感染的细胞作为正常对照组。细菌培养至对数期后，以100：1的感染复数（multiplicity of infection，MOI）感染细胞。在细菌细胞共培养1h后向培养基中加入终浓度100μg/ml的阿米卡星（Amikacin，AMK）杀灭胞外菌。AMK作用2h后更换培养基，使AMK浓度降至10μg/ml以抑制从感染细胞中释放至培养基中的细菌生长。分别在共培养后1h、3h和5h收集细胞，用共聚焦激光扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）观察胞内LC3-Ⅱ黄色点状结构。2.以野生株χ3306lux和突变株UF110lux感染HeLa细胞，按上述方法制备细胞感染模型。分别在感染后1h、3h和5h收集细胞，用蛋白免疫印迹法（Westernblot，WB）检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1和p62蛋白的表达情况，通过检测胞内菌生物发光强度追踪细菌胞内繁殖情况，并用平板菌落计数法检测胞内集落形成单位（colony forming unit，CFU）。三、spv基因对体内感染过程的影响用野生株χ3306lux和突变株UF110lux腹腔注射感染小鼠，建立体内感染模型，以注射等量生理盐水的小鼠作为正常对照组。（1）感染后6h、1d、2d、3d、4d和5d记录小鼠的体重变化和存活情况。（2）为检测细菌生物发光强度追踪细菌在不同脏器的定位取小鼠麻醉，用小动物活体成像仪观察两组细菌在小鼠体内的繁殖和播散。每组随机抽取小鼠处死并分离肝脏、脾脏和盲肠，观察脏器形态学变化并检测生物发光强度。（3）随机抽样用平板菌落计数法检测小鼠肝脏和脾脏的胞内CFU，WB检测肝脏自噬相关蛋白Beclin-1和p62的表达。结果：一、生物发光菌株的构建以含NaCl浓度15g/L的高渗LB培养基培养细菌至OD600为0.3，制备浓度为1010cfu/mL的感受态细胞，在参数为2.5kV,400,50μF条件下，用常规方法难以转化的大质粒pBEN276转化受试菌后成功获得转化子。诱导重组后，经PCR鉴定及生物发光检测，成功构建了稳定发光的鼠伤寒沙门菌菌株χ3306lux和UF110lux。二、沙门菌质粒毒力基因spv对HeLa细胞自噬的影响1. CLSM检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ结果显示，细菌和细胞共培养1h后，野生株χ3306lux感染组细胞内LC3-Ⅱ的黄色荧光点状聚集数量明显低于突变株UF110lux感染组（p<0.05），3h和5h时两组黄色荧光点状聚集数量未见明显差异（p>0.05）。2. WB检测结果显示，在细菌和细胞共培养1h后，野生株感染组细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表达低于突变株感染组（p<0.05），3h和5h未见明显差异（p>0.05）。在细菌和细胞共培养1h后，野生株感染组细胞自噬底物蛋白p62表达高于突变株感染组（p<0.05），3h和5h未见明显差异（p>0.05）。胞内菌生物发光检测结果显示，在细菌和细胞共培养1h后，两感染组间胞内菌生物发光强度未见明显差异（p>0.05），共培养3h和5h后，野生株感染组胞内菌生物发光强度高于突变株感染组（3h，p<0.05；5h，p<0.01）。平板菌落计数结果显示，在细菌和细胞共培养1h后，两感染组间胞内活菌数未见明显差异（p>0.05），共培养3h和5h后，野生株感染组胞内活菌数高于突变株感染组（3h，p<0.05；5h，p<0.01）。三、spv基因对体内感染过程的影响1.动物模型结果显示，在感染后1-5d，野生株感染组和突变株感染组小鼠均有毛发凌乱，活动少，精神状态差，腹泻消瘦等现象，以野生株感染组小鼠为重且存活率更低。对照组小鼠毛发有光泽，活动多，精神状态好，体重基本维持不变。2.小动物活体成像结果显示，感染后2d，野生株和突变株感染组体内均可检测到发光的细菌，同一时间点野生株生物发光强度高于突变株感染组。随着感染时间的延长，野生株感染组细菌在小鼠体内的繁殖和扩散速度较快，至5d已播散至全身，而突变株感染组繁殖和扩散程度却较慢。解剖小鼠后观察肝、脾和盲肠形态学变化，发现野生株和突变株感染组与对照组相比，肝脏、脾脏明显增大，盲肠缩短并出现水泡样病变；野生株感染组与突变株感染组相比，肝脏和脾脏肿大更严重，肝脏表面出现点状病灶，盲肠缩短更多且水泡样病变更重，表面充血更重。生物发光检测结果显示，野生株感染组各脏器内细菌发光强度高于突变株感染组。3.肝脏和脾脏胞内活菌计数结果显示，野生株感染组肝脏和脾脏胞内活菌数均高于突变株感染组（p<0.05）。WB检测结果显示，在感染后6h、1d和2d，野生株感染组小鼠肝脏和脾脏中Beclin-1蛋白的表达明显高于突变株感染组（p<0.05），p62蛋白的表达明显低于突变株感染组（p<0.05），3d至5d两组未见明显差异（p>0.05）。结论：1.以优化的电转化条件成功构建了鼠伤寒沙门菌稳定生物发光菌株，为今后在体内外实时动态追踪沙门菌感染提供了有效工具。2.沙门菌质粒毒力基因spv能影响HeLa细胞自噬水平，以利于宿主菌在细胞内的存活。3. spv基因可提高宿主菌的致病性，促进其在机体内的繁殖和播散，加重感染进程。