黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂薄层生物自显影活性筛选体系的建立及初步应用

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黄嘌呤氧化酶是体内核酸代谢中重要的酶,广泛分布于人体心、肺、肝等组织细胞浆内。黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤和次黄嘌呤的氧化生成尿酸,并产生过氧化物自由基,黄嘌呤氧化酶代谢紊乱会导致高尿酸血症,引发痛风等重大疾病。所以黄嘌呤氧化酶抑制剂和超氧阴离子清除剂在临床上具有重要的意义。目前广泛使用的黄嘌呤氧化酶抑制剂主要是别嘌呤醇,非布索坦,超氧阴离子清除剂则主要为BHT,BHA等化学合成类药物,然而在使用这些药物的治疗过程中出现很多不良反应和副作用。所以从天然药物中寻找有效,低毒,价廉的黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂更是成为目前研究热点。本文就上述问题,建立了黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂的薄层色谱-生物自显影筛选体系,希望能够快速,简便,准确的筛选天然产物中具有抑制黄嘌呤氧化酶或者清除超氧阴离子作用的成分,并采用该方法对补骨脂中的化学成分进行了活性导向分离。将该方法初步应用于治疗缺血再灌注损伤有效的中药黄芪的薄层鉴别研究。  一黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂的薄层色谱-生物自显影筛选体系的建立  以黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂筛选体系为研究对象,对检测波长、薄层板种类、显色方式、黄嘌呤氧化酶的浓度、显色剂的浓度、黄嘌呤氧化酶活化时间、反应后显色时间等实验参数进行了考察,建立了用于黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂的薄层色谱-生物自显影筛选体系,测定了该方法的检测限,建立了标准曲线,对该方法的适用性、同板精离度、异板精密度、板间重复性、日间重复性、准确度(即回收率)进行了测定,表明该筛选体系重复性、准确度和精密度良好。同时对不同结构类型的化合物进行了活性测定并且与试管反应(紫外分光光度法)的实验结果进行比较,结果表明两干中方法的测定结果具有一致性。因此该筛选体系适用于不同实验室、不同操作者、不同时间、不同结构类型化合物的黄嘌呤氧化酶抑制活性或者超氧阴离子清除活性的测定。  二利用黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂的薄层色谱-生物自显影筛选体系对中药补骨脂中的化学成分进行活性导向分离  采用已建立的黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂的薄层色谱一生物自显影筛选体系的活性测定结果为导向,对利用不同比例的石油醚和乙酸乙酯洗脱补骨脂总浸膏得到的五个部位进行了黄嘌呤氧化酶抑制活性或者超氧阴离子清除活性测定,结果发现石油醚-乙酸乙酯(4:1)洗脱的部位Fr.D中活性成分较多,而且含量比较高,所以重点以黄嘌呤氧化酶薄层生物自显影为导向对部位Fr.D进行分离,分离得到了8个化合物,补骨脂素,异补骨脂素,补骨脂异黄酮,补骨脂定,补骨脂查尔酮,异补骨脂查尔酮,Bakuchalcone和3’,4’-(3-hydroxy-2,2-dimethyldihydropyrano)-4,2’-dihydroxychalcone,其中3’,4’-(3-hydroxy-2,2-dimethyldihydropyrano)-4,2’-dihydroxychalcone为属内首次分离得到。  三黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂薄层色谱生物自显影活性筛选体系初步应用于中药黄芪的薄层鉴别研究  利用已建立的黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂薄层色谱生物自显影活性筛选体系对中药进行定性鉴别,我们选取黄芪为研究对象,通过薄层生物自显影方法对其中的活性成分进行鉴定,并改进了黄芪前处理条件,用C18SPE小柱对黄芪甲醇提取液进行前处理,为了得到活性成分丰富的部位,对SPE小柱的洗脱体积进行了考察,通过研究发现黄芪中的成分能够在该方法中表现出抑制活性,为以后利用该方法对黄芪进行定性鉴别提供了可能性。
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