犬科动物白细胞在受到外界特定刺激后会分泌一系列的细胞因子,Ca IFNα是其中比较重要的一类。犬α干扰素的抗病毒作用由其通过一系列受体(IFN-R1和IFN-R2)进行信号传导最终导致ISGs(干扰素刺激基因产物)的产生。ISGs通过抑制病毒核酸的转录翻译及蛋白合成而发挥抗病毒作用。Ca IFNα具有广谱抗病毒、加强应答反应、弱抗原性等一系列特点,故具有较好的临床应用前景。毕赤酵母表达系统是一类较早被人类成功改造并已经普遍应用于外源蛋白表达的蛋白表达系统。相对于其他的表达系统来说具有能分泌表达、易于纯化、通过高密度发酵大量表达等特点,拥有良好的工业化基础,是实现外源蛋白大规模生产进而推动其实现商品化的重要方法。本研究在以MF-α因子为前导信号肽的犬α干扰素重组工程菌株GS115-p PIC9K-MF-Ca IFN-α为基础进行了以下研究。研究内容1:根据基因序列设计引物用PCR和酶切方式对Ca IFN-α,MF-α基因序列进行了验证。利用单因素方法和正交试验方法对工程菌的生长过程中的各种条件和诱导表达过程中的各种重要条件进行优化。得出了其最适生长条件:生长最适温度30℃、生长初始p H值6.0、生长初始甘油含量2%、种子接种量为10%、摇瓶装液量为摇瓶总体积的20%。最适诱导表达条件:诱导剂甲醇的添加量为1%、诱导初始p H6.0、最佳诱导时间72h、最适诱导温度28℃。另外在整个诱导过程中每隔12h加入1%的酪蛋白可以有效避免蛋白降解提高其产量。通过一系列的优化之后目的蛋白表达量得到了有效的提高,结果表明优化后产量提高了约76%。研究内容2:在摇瓶优化的基础上利用上海万木春公司生产的50L发酵罐对GS115酵母工程菌进行了发酵。检测并绘制了在发酵过程中的生长曲线,溶氧曲线,确定了发酵诱导过程中甲醇含量的检测方法并对诱导过程中甲醇含量进行了检测,结果显示以与溶氧关联的方式添加甲醇补料能够使发酵液中甲醇含量接近摇瓶优化的最适值。同时还确定了GS115工程菌在发酵罐中诱导表达最适p H为7.0,最佳诱导时间约为62h。以优化后条件发酵最终获得了约占总蛋白含量80%以上浓度约为0.74mg/m L的目的蛋白。研究内容3:通过G-25脱盐、疏水层析、离子交换层析对摇瓶培养诱导及发酵后上清进行纯化,获得了纯度纯度为91.4%、95.7%的目的蛋白。测定了纯化后的目的蛋白浓度,摇瓶诱导纯化后浓度为0.24mg/m L,收率约为58%,发酵后纯化目的蛋白浓度为0.56mg/m L,回收率约为43%。通过Western-blot鉴定目的蛋白。研究内容4:利用MDCK-VSV检测系统测定了摇瓶培养及发酵纯化后目的蛋白的活性,分别为1.08×10~8 U/mg和1.92×10~8 U/mg。检测了摇瓶培养及发酵后目的蛋白在MDCK上抗CDV活性分别为3.15×10~6 U/mg,5.74×10~6 U/mg。