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Neuromedin S (NMS)是Mori等人于2005年从大鼠下丘脑视交叉上核中分离出来的一种神经肽,为孤儿受体G蛋白藕联受体(TGR-1和FM-3)的内源性配体,它以视交叉上核英文名称的首字母S命名。NMS主要是通过结合其功能性受体NMU2R发挥调节作用,参与调节动物的摄食、能量代谢、神经内分泌和睡眠节律等多种生物学功能。较早的研究证实NMS也参与动物的生殖调控,但是相关研究主要集中在鼠上。本文以母猪为研究对象,采用基因同源克隆、半定量RT-PCR、免疫组织化学、原位杂交、实时荧光定量RT-PCR、细胞培养和放射免疫分析技术等方法系统研究了NMS在下丘脑-垂体-卵巢轴上对母猪生殖的调节机制。研究的主要内容有：猪NMS和受体(NMU1R和NMU2R)的基因克隆及表达；NMS和受体NMU2R在猪体内的分布定位；在发情周期内的不同阶段(发情前期、发情期、发情后期和间情期)母猪下丘脑-垂体-卵巢轴上NMS和NMU2R mRNA的表达变化；NMS对母猪生殖轴的体外作用；侧脑室注射NMS给去卵巢母猪和促黑激素皮质素(MSH)受体拮抗剂SHU9119预处理的去卵巢母猪对血清中LH水平和下丘脑-垂体轴上与生殖相关的激素或受体mRNA表达的影响。上述的研究内容旨在从体内到体外,从分子水平到细胞水平,从形态学到生理学等方面系统探讨NMS对猪生殖的调控机制。猪NMS及其受体的基因克隆和表达本实验采用同源克隆技术克隆了猪NMS及其两个受体(NMU1R和NMU2R)的基因,并提交至GenBank数据库中获得登录号为：GQ502200 (NMS)、FJ949607(NMU1R)和FJ158599(NMU2R)。同时,采用半定量RT-PCR的方法研究NMS和NMU2R mRNA在猪体内的表达情况。结果如下：半定量RT-PCR实验结果表明NMS mRNA在猪体肉的23种组织内均有表达,高水平NMS mRNA主要在延髓、脑桥、脾、肠系膜前淋巴结、脊髓、卵巢、心、垂体、下丘脑、肾、结肠,盲肠、胸腺和舌肌表达；低水平NMS mRNA主要在肺、肝、肾上腺、胃、十二指肠、甲状腺、腮腺、子宫和空肠表达。NMU2R mRNA主要在上述23个组织中的19种有表达,高水平NMU2R mRNA主要在猪下丘脑、垂体、脊髓、卵巢、脾、肠系膜前淋巴结、胸腺、腮腺、舌肌、肝、十二指肠、甲状腺、肺和子宫表达；低水平NMU2R mRNA主要在猪脑桥、延髓、回肠和盲肠表达；在胃、空肠、结肠、肾和肾上腺中未见其表达。二NMS在猪体内的分布定位原位杂交的结果显示：在中枢神经系统,NMS阳性细胞主要分布于下丘脑、垂体、海马、脑桥和脊髓,阳性细胞主要呈纺锤形和多角状；NMS阳性纤维主要投射至脑桥,还有少量的阳性纤维投射至丘脑,阳性纤维主要呈念珠状分布；在外周组织器官中,NMS阳性细胞主要分布于猪消化器官、内分泌器官、免疫器官和生殖器官。三NMU2R在猪体内的分布定位免疫组织化学结果显示：NMU2R免疫阳性细胞在猪间脑、垂体、海马及部分外周组织器官中均有分布。在间脑内,NMU2R免疫阳性神经元主要分布于下丘脑室旁核、室周核、弓状核、下丘脑外侧区、丘脑腹内侧核和穹窿周核,NMU2R免疫阳性纤维主要投射至猪丘脑腹内侧核、下丘脑室旁核、室周核、外侧区、弓状核、结节乳头体核、视束和大脑脚。在垂体内,NMU2R免疫阳性细胞在垂体前后叶均有分布。在外周器官中,NMU2R主要分布于卵巢、输卵管、肾上腺、脾、淋巴结、胃和肠等组织器官中。四发情周期内不同阶段的猪下丘脑-垂体-卵巢轴上NMS和NMU2RmRNA的表达本实验用半定量RT-PCR方法,研究了16头母猪在发情周期不同阶段(发情前期、发情期、发情后期和间情期,n=4)下丘脑-垂体-卵巢轴上NMS和NMU2R mRNA表达的变化,结果如下：在母猪的整个发情周期中下丘脑-垂体-卵巢轴上均有NMS和NMU2R mRNA的表达,但它们的表达模式不同。猪下丘脑NMS mRNA在发情前期的表达丰度最高,发情期降低,随后其表达量开始升高,发情后期的表达量高于发情期的表达量,间情期阶段略有下降,发情前期和发情后期的表达丰度极显著高于发情期(P<0.01),间情期的表达水平也显著高于发情期(P<0.05)。猪下丘脑NMU2R mRNA在发情前期的表达丰度最高,发情期的表达水平出现最低值,发情后期的表达水平又升高,间情期的表达水平继续升高,但是低于发情前期的水平；发情期NMU2R mRNA的表达丰度均低于发情前期、发情后期和间情期时的表达丰度,差异极显著(P<0.01)。猪垂体NMS和NMU2R mRNA在猪发情周期内的表达模式与其在下丘脑的相似。在发情前期的表达丰度最高,在发情期最低。卵巢NMS和NMU2R mRNA的表达模式与下丘脑和垂体中的表达模式不同。卵巢NMS mRNA在发情前期的表达水平最低,然后从发情期开始逐渐升高至间情期的最高表达丰度；NMU2R mRNA在发情后期时表达丰度最高,在发情期的表达丰度最低。五NMS对母猪生殖轴的体外作用研究为探讨NMS在生殖调节中的直接作用位点,我们利用体外培养的猪下丘脑脑片、腺垂体细胞和卵巢细胞,研究了1、10、100和1000 nM NMS对体外培养的猪下丘脑脑片中GnRH、腺垂体细胞中LH、FSH和PRL及卵巢细胞中E2释放的影响。结果如下：与对照组相比,1、10、100和1000 nM NMS均能刺激孵育的下丘脑脑片GnRH的释放,其中100和1000 nM NMS组能极显著刺激GnRH的释放(P<0.01),1和10 nMNMS组对GnRH的释放也有轻微促进作用(P>0.05)；56 mM KCl组能极显著刺激GnRH的释放,高K+溶液在NMS处理后仍能极显著刺激GnRH的释放(P<0.01),表明NMS处理的各组下丘脑脑片活性良好,能用于试验。NMS所有剂量组对猪腺垂体细胞LH的释放均有促进作用,且呈剂量依赖性,其中100和1000 nM NMS能极显著促进猪腺垂体细胞LH的释放(P<0.01),10 nMNMS能显著促进猪腺垂体细胞LH的释放(P<0.05),1 nM NMS仅能轻微促进LH的释放(P>0.05)。1、10、100和1000 nM NMS均能轻微促进猪垂体细胞中FSH的分泌(P>0.05)。1、10、100和1000 nM NMS均能促进猪垂体细胞中PRL的释放,其中1 nM NMS组能极显著刺激PRL的释放(P<0.01),10 nM也能显著促进PRL的释放(P<0.05)；100和1000 nM NMS组对猪垂体细胞中PRL分泌有轻微促进作用(P>0.05)。1、10、100和1000 nM NMS均能刺激卵巢细胞E2的释放。然而,1、100和1000nM NMS与对照组相比差异不显著(P>0.05),10 nM NMS能显著刺激卵巢细胞E2释放(P<0.05)。六侧脑室注射NMS给去卵巢母猪后血清中LH的变化为了探讨NMS在体内对促黄体生成素(LH)分泌的影响,本实验用放射免疫测定法检测了侧脑室注射NMS给去卵巢母猪(NMS注射组)和SHU9119预处理的去卵巢母猪(SHU9119+NMS注射组)对血清中LH水平的影响(每6 min采集血样一次),结果如下：给去卵巢母猪侧脑室注射0.2 nM NMS,血清中LH水平在NMS注射后出现明显降低趋势,在注射NMS后12 min时开始降低,在注射后24 min时出现最低值(P<0.01)；这种较低的LH水平一直持续到NMS注射后的1h,之后,LH水平逐渐恢复,与对照组相比没有显著差异(P>0.05)。换句话说,注射NMS后的1h内,NMS注射组猪LH水平持续54 min保持在较低水平；与对照组相比,NMS注射组猪LH的基础分泌降低了约42.66%(P<0.01)。侧脑室注射1.0 nM SHU9119后,再注射NMS给去卵巢母猪,猪血清中LH的水平没有出现显著变化(P>0.05)；与NMS注射照组相比,SHU9119+NMS注射组猪血清中LH水平极显著升高(注射NMS后的1h内)(P<0.01)；与对照组相比,SHU9119+NMS注射组猪血清中LH水平和LH的基础分泌均无显著变化(P>0.05)。七去卵巢母猪侧脑室注射NMS对下丘脑-垂体轴上与生殖相关的激素或受体mRNA表达的影响为了探讨NMS在体内对下丘脑-垂体轴上与生殖相关的激素或受体mRNA的表达是否有影响,本实验采用实时荧光定量RT-PCR方法检测了侧脑室注射NMS给去卵巢母猪(NMS注射组)和SHU9119预处理的去卵巢母猪(SHU9119+NMS注射组)下丘脑-垂体轴上与生殖相关的GnRH、LH、FSH、NMU2R、PR和ER mRNA表达的影响,结果如下：NMS注射组、SHU9119+NMS注射组和对照组猪下丘脑-垂体轴上GnRH、LH、NMU2R、PR和ER mRNA均有表达,但它们的表达水平发生显著变化(ER mRNA除外)。NMS注射组猪下丘脑GnRH mRNA的表达水平,与空白对照组和SHU9119+NMS注射组相比极显著降低(P<0.01)。SHU9119+NMS注射组猪下丘脑GnRH mRNA的表达与对照组的表达水平相当(P>0.05)。NMS注射组猪下丘脑和垂体NMU2R和PR mRNA的表达水平,与SHU9119+NMS注射组和空白对照组相比极显著升高(P<0.01)。SHU9119+NMS注射组猪下丘脑和垂体NMU2R和PR mRNA的表达水平与对照组的表达水平相当(P>0.05)。与对照组和SHU9119+NMS注射组相比,NMS注射组猪垂体LH mRNA表达水平极显著降低(P<0.01)；SHU9119+NMS注射组猪垂体LH mRNA的表达与对照组相比有所升高,但差异不显著(P>0.05)。上述3组猪下丘脑和垂体ER mRNA的表达在注射前后无显著变化(P>0.05)。以上研究表明,NMS和NMU2R在猪下丘脑、垂体和卵巢均有分布,为NMS在下丘脑-垂体-卵巢轴上参与对生殖的调控提供了形态学实验依据；母猪发情周期不同阶段NMS和NMU2R mRNA在生殖轴上的表达呈现规律性变化,表达模式与下丘脑、垂体和卵巢中一些生殖激素的分泌特点有关,提示NMS可能参与对这些生殖激素分泌的调节；侧脑室注射NMS对去卵巢母猪血清中LH水平和下丘脑GnRH及垂体LH mRNA表达的抑制作用及对下丘脑和垂体NMU2R和PR mRNA表达的促进作用,可被SHU9119预处理所阻断,提示NMS对去卵巢母猪生殖功能的抑制作用可由MSH介导。上述的这些研究结果为NMS在繁殖轴上参与母猪的生殖调控提供了形态学和生理学实验资料。