目的自20世纪70年代以来,中国的恶性肿瘤发病率和病死率呈明显上升趋势,现已成为我国城乡居民的首要死因。其中,肺癌发病率和病死率的上升趋势尤为明显,虽然以手术为主的多学科综合治疗以及个体化治疗的进步,其病死率位列所有恶性肿瘤之首。因此,只有不断完善肺癌发病机制的研究并由此开展新的治疗方法,才能有效提高肺癌疗效和预后。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)IAP家族首先由Losis Miller等在杆状病毒CpGV和OPMNV发现,是一类新的独立于Bcl-2的抗凋亡蛋白。目前人类IAP家族已发现有8个成员,所有的IAPs都含有至少一个杆状病毒IAP重复基序结构(baculovirual inhibitor of apoptos is repeats,BIR),它的功能是特异性结合终末细胞死亡效应蛋白酶,例如半胱天冬酶(caspases)-3和-7,结合的结果导致caspases活性显著降低,从而抑制了各种凋亡因子导制的细胞死亡。Livin是新近发现的一种IAP家族成员之一,其组织分布具有明显的细胞选择性,特异性表达于人的胚胎组织以及大多数人类实体瘤细胞。在正常成人组织如:脾、胸腺、前列腺、睾丸、小肠、结肠、卵巢、肝、肺、脑、骨骼肌和淋巴细胞以及外周血中无表达或低表达。Livin同样含有IAP家族成员特有的BIR和RING指结构域。与IAP家族其他成员氨基酸序列相似程度分别是:NAIP为25.5%、cIAP-1为24.1%、cIAP-2为26.1%、XIAP为34.7%、Survivin为26.3%。其高级结构更类似Survivin(生存素),含有4个α螺旋和一个反平行β折叠的BIR结构域(含一个丝/苏氨酸磷酸化位点),C端有RING结构域,但没有Survivin的螺旋-螺旋结构域。一些资料显示,Livin抗细胞凋亡的作用强于Survivin。Livin抗细胞凋亡作用主要是通过它的BIR结构和caspases结合,从而抑制caspses活性,特别是抑制Caspase3/7和Caspase 9。研究表明,抑制凋亡可以导致癌症的发生和发展。同Survivin一样,凋亡抑制基因Livin在癌细胞系和变异细胞系中高表达,而在正常分化的组织中低或无表达。但目前国内外文献罕见小细胞肺癌中Livin表达情况的报道。为此,我们采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术检测30例小细胞肺癌组织和16例癌旁5cm以上正常肺组织中LivinαmRNA和LivinβmRNA的表达,并结合Western blot方法分析Livin蛋白的表达情况;采用免疫组织化学方法检测了30例小细胞肺癌组织和16例癌旁5cm以上正常肺组织中Livin蛋白及Caspase-3、P53蛋白的表达,并探讨Livin与Caspase-3和P53之间的关系。我们还应用流式细胞术,对小细胞肺癌细胞的增殖活性和凋亡水平进行检测分析,期望证明Livin表达与肿瘤细胞的增殖和凋亡有关。材料与方法一、实验材料标本来源于中国医科大学第一临床学院胸外科和大连医科大学第一临床学院胸外科2003年1月～2006年10月手术的患者,其中小细胞肺癌患者30例,癌旁5cm以上正常肺组织16例;男性例22,女性8例,年龄34～71岁,平均年龄54.53岁。按照1997年国际抗癌联盟TNM分期,Ⅰ期12例,Ⅱ期10例,Ⅲ期8例。30例肿瘤组织中,17例有淋巴结转移。所有患者术前均未行放、化疗。二、实验方法1、逆转录PCR检测Livin基因表达取100mg待检测组织,加入1ml Trizol溶液彻底匀浆。按Trizol试剂盒说明书用一步法提取总RNA,用DNA/RNA测定仪测定RNA浓度和纯度。反应体系中加入10×RNA PCR Buffer 1μl、dNTP 1μl、MgCl2 2μl、Random 9mers 0.5μl、RNA 1μl、RNase inhibitor 0.25μl、Reverse Transcriptase 0.5μl、ddH2O 3.75μl。反应条件:30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min。Livin基因引物序列为5’-CATGGGTCTCCGTCCTCG-3,(上游)和5’-CAGGGAGCCCACTCTCGT-3’(下游)。在12.5μl反应体系中含有灭菌ddH2O7.16μl、20pmol/L上、下游各0.15μl、cDNA2.5μl、Taq Hs 0.04μl、5×Buffer 2.5μl。反应条件:95℃2min,95℃1min,58℃1min,72℃1min,30个循环;72℃延伸7min。用内参照β-肌动蛋白(β-actin)检测逆转录效率。取2μlPCR产物与2μlLodding Buffer混合,反应产物经2%琼脂糖凝胶102V、160mA下55min电泳。EB液浸泡4min,蒸馏水清洗,在紫外线下成像。凝胶成像仪成像分析,计算目的基因mRNA的相对含量。应用TaKaRa公司100bp梯度Makers为分子大小对照确定电泳条带。2、Western印迹杂交RIPA buffer 200μl裂解冰冻组织标本;采用Folin-酚试剂法进行蛋白定量;聚丙烯酰胺凝胶电泳;NC膜(Millipore,USA)转膜2h,加入Livin兔抗人多克隆抗体(1:3000,IMGENEX,USA)和β-actin鼠抗人单克隆抗体(1:400,SIGMA,USA),室温孵育2h。加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔和马抗鼠单克隆二抗,室温孵育2h,碱性磷酸酶显色15min,于自动电泳凝胶成像分析系统下成像,UPV凝胶分析系统采集数据。3、免疫组化法检测Livin、Caspase-3、P53蛋白表达采用链霉菌抗生物素蛋白—过氧化酶连接(Streptavidin-peroxidase S-P)免疫组织化学方法,一抗Livin兔抗人多克隆抗体(美国IMGENEX公司产品),工作浓度1:2000;一抗Caspase-3兔抗人多克隆抗体(美国Santa Cruz公司产品),工作浓度1:200;一抗P53兔抗人多克隆抗体(武汉博士德公司产品),工作浓度1:100;S-P试剂盒为福州迈新公司产品。实验步骤按试剂盒说明书进行。将已知阳性胃癌切片为阳性对照,用PBS代替一抗作为阴性对照。胞核、核膜或胞浆染为淡黄至棕黄色者为阳性细胞标志,将阳性细胞按其数量及显色强度分为3级:弱阳性(+)、阳性(++)和强阳性(+++)。4、流式细胞术检测小细胞肺癌细胞的增殖活性和凋亡水平切取深低温保存的组织块,网挫方法制备单细胞悬液,以PBS调整细胞数为1×106/ml。一份加PI染色液(PI 5mg,Rnase 2mg,TritonX-1001ml,生理盐水65ml,枸椽酸钠100mg,加蒸馏水至100ml)1ml,置4℃冰箱中避光染色30min后上机分析。另一份中加入FITC-AnnexinV及PI各5μl,室温下避光静置15min后上机分析。所使用的流式细胞仪为FACSCalibur型(B.D,USA)。光源为488nm氩离子激光器,FITC受激发后发绿色荧光,PI发红色荧光,每份标本计数10000个细胞,然后在Macintosh 9.5计算机上用相关软件分析数据。测量前,以人淋巴细胞作为标准品调校仪器的CT值在3.0%以内。应用MetaMorph(CellQuest3.0)细胞周期分析软件,计算DNA组方图各时相分布的百分比,以增殖指数(proliferation index,PI)表示增殖活性。二维点阵图上FITC高染而PI低染(FITC+PI-)者为早期凋亡细胞,计算其所占的百分比。三、统计学分析Livin在小细胞肺癌表达方面不同样本率之间的比较用χ~2检验。Livin与Caspase-3、P53之间的关系采用双向有序列联表资料的χ~2检验。流式细胞术检测增殖和凋亡所得数据采用t检验。应用SPSS13.0软件进行统计分析,P＜0.05为有统计学意义。结果1、Livin基因在小细胞肺癌组织中的表达情况Livin基因在30例小细胞肺癌组织中表达阳性率为63.33%(19/30),而在16例癌旁正常肺组织中低表达,阳性率为12.5%(2/16)两者之间差异显著(P＜0.05),两种异构体基本同时表达;RT-PCR和Western-blot两种检测方法结果一致。2、Livin基因的表达与小细胞肺癌组织临床病理特征的关系Livin基因的表达与小细胞肺癌患者的年龄、性别、肿瘤的TNM分期、淋巴结转移和肿瘤大小均无关(P＞0.05)。3、小细胞肺癌组织中Livin蛋白表达与Caspase-3、P53蛋白表达的相关性Livin蛋白在30例小细胞肺癌组织中表达阳性率为56.67%(17/30),而在16例癌旁正常肺组织中低表达,阳性率为12.5%(2/16)两者之间差异显著(P＜0.05)。17例Livin蛋白表达阳性的小细胞肺癌组织中有2例Caspase-3蛋白表达,13例Livin蛋白表达阴性的小细胞肺癌组织中有6例Caspase-3蛋白表达,经统计学检测发现,Livin蛋白表达与Caspase-3蛋白表达呈负相关(r=-0.359,χ~2=4.455,P=0.035)。17例Livin蛋白表达阳性的小细胞肺癌组织中有12例P53蛋白表达,13例Livin蛋白表达阴性的小细胞肺癌组织中有2例P53蛋白表达,经统计学检测发现,Livin蛋白表达与P53蛋白表达呈正相关(r=0.481,χ~2=9.020,P=0.003)。4、小细胞肺癌组织Livin基因表达与肿瘤细胞增殖的相关性30例小细胞肺癌组织的细胞增殖指数(PI)平均为(30.89±7.17)%。RT-PCR和Western-blot结果中,19例小细胞肺癌组织Livin表达阳性,PI为(35.50±4.08)%;11例Livin表达阴性,PI为(22.92±3.01)%,两者比较差异有显著性(t=8.891,p＜0.01)。5、小细胞肺癌组织中Livin基因表达与肿瘤细胞早期凋亡的相关性30例小细胞肺癌组织的肿瘤细胞早期细胞凋亡率平均为(3.24±0.74)%。RT-PCR和Western-blot结果中,19例小细胞肺癌组织Livin表达阳性,肿瘤细胞早期细胞凋亡率平均为(2.77±0.34)%;11例Livin表达阴性,肿瘤细胞早期细胞凋亡率平均为(4.04±0.51)%,两者比较差异有显著性(t=-8.194,p＜0.01)。结论1、Livin基因在小细胞肺癌中高表达,而在癌旁正常肺组织中低表达。2、Livin基因的表达与小细胞肺癌患者的年龄、性别、肿瘤的TNM分期、淋巴结转移和肿瘤大小均无关。3、小细胞肺癌组织中凋亡抑制蛋白Livin与Caspase-3蛋白表达呈负相关,而与P53蛋白表达呈正相关。4、小细胞肺癌组织Livin基因表达与肿瘤细胞增殖有关。5、小细胞肺癌组织Livin基因表达与肿瘤细胞早期凋亡有关。