芍药(Paeonia lactiflora Pall.),和牡丹一样,是我国传统名花。长期的人工选择培育出若干色彩、花型变异丰富的栽培品种,使其具有极高的观赏价值。前人研究表明,芍药的花型的变化主要来源于雌、雄蕊的瓣化和花瓣数目的自然增加两个方面,但对于芍药花型形成相关的分子机制缺乏较为深入的研究。鉴于此,本研究以芍药花型中较为特殊的托桂型开展研究,以托桂型品种‘紫凤羽’内、外花瓣组织为材料,通过比较(无参)转录组学和蛋白质组学联合分析来筛选芍药花型调控的相关基因;在此基础上,对重要候选基因APETALA2(PlAP2)进行RACE克隆、生物信息学分析、基因表达特性以及启动子区甲基化调控等功能验证,同时从密码子偏好性层面入手,利用多元统计分析探讨芍药转录组及该关键候选基因密码子使用模式。主要研究结果如下:1.芍药‘紫凤羽’内、外花瓣组织RNA-seq 比较转录组分析芍药‘紫凤羽’内、外花瓣的组织RNA-seq转录组测序结果显示,共获得394.46 Mb个读长(cleanreads),43,704个具有功能注释的非重复序列基因(Unigenes),内、外花瓣两组之间存在979个差异表达基因(DEGs),其中外瓣组上调408个DEGs。GO功能分析表明,DEGs主要在代谢途径、单细胞途径、细胞器和膜结构、酶催化活性和分子结合等富集程度较高;KEGG通路富集分析显示,DEGs主要在信号转导、次生代谢生物合成、糖类代谢、萜类与聚酮化合物代谢等通路中富集程度较高,并筛选出PISTILLATA(PI)、APETALA2(AP2),Agamous-like MADS-box UGL6)、AGAMOUS(AG)等重要花器官发育相关基因。2,芍药‘紫凤羽’内、外花瓣组织iTRAQ比较蛋白质组学分析及候选基因筛选(1)芍药‘紫凤羽’内、外花瓣组织的iTRAQ蛋白质组学分析显示,两组之间共筛选出266个差异表达蛋白(DEPs),其中外瓣组上调115个DEPs。GO功能分析显示,DEPs主要参与生物学过程分类中的代谢途径(131 DEPs)、单细胞途径(102 DEPs),细胞组成分类中的细胞外基质(12 DEPs)、液泡(12 DEPs),分子功能分类中的酶催化活性(137 DEPs)。KEGG通路富集分析显示,DEPs主要富集在10个重要信号通路,其中包括生物氧化、糖酵解和糖异生等,并筛选出丙酮酸脱羧酶(PDC2)、醛脱氢酶家族(ALDH3F1、ALDH2B7)、花分生组织决定蛋白(APETALA2)等重要差异表达蛋白。(2)基于转录组和蛋白质组学分析结果,利用Venny软件在芍药‘紫凤羽’内、外花瓣组织间筛选出39个共同差异表达基因/蛋白质,主要参与生物氧化(Biological oxidations)、糖酵解和糖质新生(Glycolysis/Gluconeogenesis)、光合作用碳固定(Carbon fixation in photosynthetic organisms)、丙酮酸代谢(Pyruvate metabolism)等信号通路。qPCR验证发现,APETALA2、ALDH3F1、PDC2、NLTP6、At1g22430基因在芍药内、外花瓣中表达差异极显著(P<0.01),进一步对APETALA2基因进行western blot验证显示,芍药‘紫凤羽’外瓣组织P1AP2蛋白表达水平明显高于内瓣组织。综合表明,APETALA2(AP2)可以作为调控芍药托桂型品种花型的关键候选基因之一,有必要对其调控作用及其机制开展分析探讨。3.芍药APETALA2(PlAP2)基因克隆及表达特性分析(1)RACE技术克隆获得芍药PlAP2基因cDNA序列全长1935 bp,其完整的开放阅读框(ORF)为1578 bp,编码525个氨基酸。蛋白结构与功能分析表明,P1AP2蛋白为亲水性不稳定蛋白,无跨膜结构和信号肽,为非分泌蛋白;核定位信号位于氨基酸序列139-KKSRRGPRS-147;二级结构包括 α 螺旋(24%)、β 折叠(19%)、β-转角(28%)和无规则卷曲(28%);存在8个糖基化位点和64个磷酸化位点,包含2个相同的保守结构域:AP2/(Ethy1ene-Responsive factors,ERF)(151-213aa 和 243-306aa);亚细胞定位主要在细胞质(45.0%)中,少量分布于微体、线粒体基质间隙和溶酶体;进化树分析表明,芍药PlAP2与牡丹高度同源且亲缘关系最近。(2)利用qRT-PCR检测PlAP2基因在不同芍药托桂型品种(‘紫凤羽’、‘彤云金焰’、‘红楼锦菊’)4个不同发育时期(花蕾期S1、初开期S2、盛开期S3、衰败期S4)中内、外花瓣表达情况,结果显示,PlAP2基因在‘紫凤羽’外瓣组织中表达水平显著高于内瓣,盛开期S3表达水平均显著高于花蕾期S1、初开期S2、衰败期S4,‘彤云金焰’表达量均显著高于‘红楼锦菊’和‘紫凤羽’品种。此外,本研究发现芍药‘紫凤羽’不同发育时期以及不同品种(‘紫凤羽’、‘彤云金焰’、‘红楼锦菊’)间的花瓣形态特征均存在明显差异,综合表明PlAP2基因表达水平与芍药花瓣发育密切相关。4.芍药花型调控候选基因APETAIA2(PlAP2)启动子区甲基化修饰分析利用染色体步移克隆获得芍药PlAP2基因5’端上游启动子区2000 bp,并且包含1个CpG岛(-665 bp～-872 bp),该区域包括NF-kappaB、GATA-1、Sp1、C/EBP等重要转录因子结合位点;BSP+Miseq甲基化测序显示,PlAP2基因启动子CpG岛区域存在7个CpG 位点(CpG-1、CpG-2、CpG-3、CpG-4、CpG-5、CpG-6、CpG-7),并且发生不同程度的甲基化修饰(19.73%～65.78%)。内瓣与外瓣组织甲基化程度差异显著性分析显示,CpG-3位点在内瓣组织中甲基化比例(45.37%)极显著高于外瓣组织(35.85%)。不同发育时期甲基化程度差异显著性分析显示,CpG-2位点在衰败期S4中甲基化比例(57.01%)极显著高于盛开期S3(40.62%),显著高于花蕾期S1(45.49%)和初开期S2(45.85%);CpG-3位点在盛开期S3中甲基化比例(32.36%)显著低于花蕾期S1(42.99%)、初开期S2(43.71%)以及衰败期S4(43.37%);CpG-3、CpG-6位点甲基化程度与mRNA表达均表现为极显著的负相关,其中CpG-3位于Sp1转录因子结合位点上。5.芍药转录组及APETALA2(PlAP2)密码子使用模式分析(1)基于芍药托桂型品种‘紫凤羽’转录组测序筛选的43,704个Unigenes,并根据CDS序列特征和大于300 bp原则进行过滤后最终获得的24,216个基因序列作为芍药转录组密码子研究对象,利用Mobyle软件计算GC含量、第1与2位密码子的平均GC含量(GC12)、第3位密码子的GC含量(GC3s)、有效密码子数ENC、密码子适应指数CAI、相对同义密码子使用度RSCU等密码子偏性指标,其次进行中性绘图(GC12 vs.GC3)、ENC-GC3s绘图以及PR2(Parity Rule 2)绘图分析,并运用多元统计分析方法探讨突变压力和选择作用对密码子使用模式的影响程度,最后以5%CAI值作为高、低表达样本组,计算这两个样本组的同义密码子相对使用度,利用卡方检验分析两组之间的显著性差异来确定最优密码子。结果显示,芍药转录组密码子GC3s含量为41.8%,大部分基因GC含量主要分布在35%～45%;中性绘图分析表明GC3s与GC12呈极显著的负相关(r=-0.03,P<0.01);ENC-GC3s绘图表明大部分基因分布在标准曲线周围,也有一部分基因分布在标准曲线下方较远的位置,同时大部分基因(ENCexp-ENCobs)/ENCexp 比值集中分布在-0.1-0.3;PR2绘图分析显示密码子第3位T的使用频率高于A,G使用频率高于C,表明嘌呤(A和G)与嘧啶(T和C)的使用频率并不均衡;对应性分析COA(Correspondence Analysis)表明,第一轴上显示了 20.55%的差异,其他3个轴分别为13.99%、12.24%、11.45%,表明芍药转录组密码子使用模式评价以第一轴(Axis 1)为主;突变压力和选择作用分析发现,第一主轴与GC3s、CAI的相关系数均达到极显著正相关(r=0.758,P<0.01;r=0.293,P<0.01);利用ΔRSCU和卡方显著性检验的方法,确定了 22个为芍药转录组最优密码子,其中大部分以A或U结尾。(2)基于组学联合分析筛选的芍药花型调控重要候选基因—APETALA2(AP2),利用R软件计算核苷酸组成(GC含量)和遗传指数如有效密码子数(Effective number of codons,ENC)、同义密码子相对使用度(Relative synonymous codon usage,RSCU)、相对密码子使用偏好性(Relative codon usage bias,RCBS)等,来分析比较不同植物AP2基因密码子使用模式中密码子偏好性和碱基组成动力学。结果显示,不同植物AP2基因密码子使用受到GC偏好性(GC bias)影响,特别是GC3s;整体碱基组成分析暗示芍药等不同植物AP2基因编码序列中密码子AT使用频率高于GC,并且大多数偏好使用以A/T结尾;芍药等不同植物中AGA、GCU和UGU均表现为较高的RSCU值,为最优势密码子;芍药(Paeonia lactiflora)和牡丹(Paeonia suffruticosa)植物AP2基因的密码子使用特点相似;AP2基因选择压力分析显示,具有较低的最优密码子频率(FOP)值和相对密码子偏好性(RCBS)值、较高的有效密码子数(ENC)值,表明芍药等不同植物AP2基因在密码子使用中具有一个较低偏好性。