马流感(Equine Influenza,EI)是由马流感病毒(Equine Influenza Virus,EIV)引起,在马属动物中传播的一种急性呼吸道传染病,其主要临床症状是发热、干咳、流鼻涕、呼吸困难、精神萎靡、食欲不振。研究表明,NP在流感病毒中具有高度同源性,是流感病毒中结构最保守的蛋白,新城疫病毒、狂犬病毒、麻疹病毒等多种RNA病毒的NP作为抗原广泛应用于ELISA诊断试剂盒。因此,本研究以重组NP为抗原建立检测血清中EIV抗体的ELISA方法在EI的快速诊断中具有重要意义。从EIV分离株A/马/黑龙江/13(H3N8)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,通过RTPCR的方法扩增得到NP基因,将其克隆到pET-32a(+)中构建原核表达质粒pET-NP,将测序正确的质粒转化表达菌株Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达、镍柱纯化获得重组NP,用Western-blot方法分析NP的抗原特性;将重组NP作为抗原包被,通过优化条件建立检测马血清中EIV抗体的ELISA方法;用建立的ELISA方法调查马流感在广东地区的流行情况,对各马场采集的95份血清样品的检测结果进行分析。结果显示,重组NP具有良好的反应原性,在最佳诱导条件下,目的蛋白可溶于上清且表达量最大;以重组NP为抗原建立的间接ELISA方法最佳反应条件:抗原包被浓度为100ng/m L,封闭液选用5%脱脂奶粉,血清稀释度为1:400,二抗最佳工作浓度为1:20,000。该检测方法具有特异性高、敏感性强、重复性好的优点;广东地区采集的样品中,EIV血清抗体的总体阳性率高达42.1%;母马血清抗体阳性率高于公马,不明品种马匹血清抗体阳性率高于其它品种;马匹的EIV血清抗体水平与品种、性别和年龄在统计学上没有显著的相关性。本研究通过原核表达获取的重组NP具有良好抗原性,利用重组NP建立的ELISA方法可为我国马流感的防控以及血清学调查工作提供技术支持。本研究获得的广东地区EIV血清抗体的检测及分析结果可为该地区EI的防控提供数据支持。