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胃癌目前仍是我国死亡人数最多的恶性肿瘤之一,转移是肿瘤最具破坏性的本质,也是胃癌患者死亡的主要原因。深刻理解胃癌转移的分子机制对指导治疗十分重要。H.pylori感染是胃癌的重要危险因素,世界卫生组织已将H.pyori列为I类致癌原,对于H.pylori感染对胃癌的侵袭转移力有无影响,尚存在争论。H.pylori感染胃癌细胞可使肿瘤转移关键蛋白ezrin蛋白表达及功能发生变化,H.pylori感染是否能通过影响ezrin及其相关分子影响胃癌的侵袭转移,是本课题的需验证的设想。目的:1、明确H.pylori感染与胃癌侵袭、转移是否相关;2、如果二者相关,探讨ezrin是否H.pylori感染与与胃癌侵袭、转移中起重要的作用;3、初步探讨ezrin在胃癌侵袭转移中可能分子机制,为H.pylori感染促胃癌进展提供新的实验依据。方法:1、利用手术切除人体胃癌标本,联合血清H.pylori抗体检测及快速尿素酶法检测H.pylori感染状态,探讨H.pylori感染与胃癌淋巴结转移、胃癌浸润深度、病理分型的相关性;利用H.pylori与胃腺癌细胞AGS体外共培养,扫描电镜观察H.pylori感染AGS细胞形态学的改变,transwell小室检测H.pylori对AGS细胞侵袭力的影响;划痕实验观察H.pylori对AGS细胞迁移力的影响;MTT法检测H.pylori感染对AGS细胞失巢存活力的影响;2、免疫组化检测ezrin在胃癌组织中的表达,并探讨其表达强弱与胃癌浸润深度,有无淋巴结转移、是否有H.pylori感染的关系;免疫组化检测胃癌组织中CD44及E-cadherin的表达,探讨与H.pylori感染是否相关。选取AGS、MKN28、BGC823三种胃癌细胞株,western blot检测三种细胞株ezrin的表达,transwell小室检测侵袭力的高低,并探讨ezrin表达和侵袭力强弱的关系;以侵袭力最弱的MKN28细胞株为研究对象,设立H.pylori感染组与PBS对照组,观察两组细胞侵袭力是否有差异,并用western blot检测ezrin及其相关蛋白CD44、E-cadhrin的表达和ezrin上游调控因子Sixl的表达。3、构建VIL-2(ezrin编码基因)的RNA干涉真核表达载体以及阴性对照载体。将干涉载体利用脂质体转染侵袭力最强的AGS细胞,经G418抗性筛选获得稳定表达的细胞株AGSezrin。半定量RT-PCR及western blot检测沉默效应。分别将AGS+PBS、AGS+H.pylori、AGSezrin+PBS、AGSezrin+H.pylori四组细胞为研究对象,扫描电镜细胞观察形态特征的变化,通过MTT、侵袭小室实验、细胞迁移实验、黏附实验观察细胞的失巢存活、侵袭和迁移、黏附能力。western blot检测ezrin、E-cadherin、CD44表达的变化。结果:1.①103例患者中,血清抗H.pylori抗体阳性71例,快速尿酶法阳性67例,二者均阳性60例,二者均阴性23例。共83例患者入组, H.pylori阳性患者淋巴结转移36例(60%),H.pylori阴性患者淋巴结转移5例(21.7%),H.pylori阳性患者与H.pylori阴性患者发生淋巴结转移率显著差异(p<0.05);H.pylori感染与肿瘤浸润深度评分无关(p>0.05),肠型胃癌45例,其中H.pylori阳性率为75.6%(34 /45) ,高于弥漫型胃癌癌灶H.pylori阳性率为42.1% ( 16 /38) ,差异显著(p<0.05)。②H. pylori与AGS细胞共培养,观察到细胞变形,相互分散,出现“蜂鸟表型”及空泡样变。电镜下观察H. pylori感染AGS细胞24小时,细胞变为长梭形,伸出细长伪足。③AGS细胞与H. pylori共孵育后行transwell实验,每200倍镜视野下穿膜细胞数130.4±11.5,高于PBS对照组87.1±9.3,差异具有统计学意义(P < 0.05)。④迁移实验中加入H. pylori的AGS细胞迁移距离均明显大于PBS对照组细胞。⑤H.pylori感染的细胞失巢培养24小时,细胞生存率高于PBS对照组(P<0.05)。2.①H.pylori阳性患者胃癌组织中ezrin蛋白表达强度高于H.pylori阴性患者(P<0.05),ezrin蛋白与胃癌浸润深度无关(P>0.05),有淋巴结转移的患者胃癌组织ezrin的免疫活性显著强于无淋巴结转移的患者(P<0.05),H.pylori感染与胃癌组织中CD44表达无关(P>0.05),H.pylori阳性患者较H.pylori阴性患者胃癌组织中E-cadherin蛋白表达显著降低(P<0.05)。②检测三种细胞系侵袭力,侵袭力最强的是AGS,其次为BGC823,最弱为MKN28。ezrin蛋白在三种细胞系中表达从高到低依次为AGS,BGC823, MKN28,在此三种细胞系中,ezrin的表达强弱与侵袭力高低一致。③以侵袭力最弱的MKN28为研究对象,加入H.pylori的感染组细胞,24小时穿膜数量为51.5±5.5 ,加入同体积的PBS的阴性对照组细胞,24小时穿膜数量为32.7±6.2。二者比较,H.pylori感染组显著多于阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),④H.pylori对MKN28细胞侵袭力的促进作用大于对AGS细胞的作用(P<0.05)。H.pylori感染促进MKN28细胞中ezrin、CD44蛋白表达,且差异显著(P<0.05,P<0.05)降低E-cadherin在MKN28中的表达(P<0.05),增加ezrin上游调控蛋白six1的表达。3、①成功构建针对ezrin转录基因(VIL2)的3种特异性干扰质粒,通过western blot及RT-PCR筛选感染效果最强的质粒转染侵袭力最强、ezrin表达最高的AGS细胞,经G418筛选建立稳定转染该感染质粒的AGSezrin细胞系;②扫描电子显微镜观察细胞表面形态学变化,AGS细胞呈椭圆形或长梭形,细胞表面粗糙,分布粗短的叶状伪足;加入100:1(细菌/细胞)H.pylori后,可见H.pylori黏附于细胞表面,细胞表面粗短突起减少,但细胞沿长轴伸出两细长突起,长度大于2倍细胞直径,AGSezrin细胞呈多边形或类圆形,细胞表面向四周伸出较多细长丝状伪足,可见较丰富的细胞间连接,亦见凋亡细胞;加入100:1(细菌/细胞)H.pylori后,细胞表面几乎被黏附的H.pylori覆盖,细胞仍呈多边形,细胞向周边辐射状伸出丝状伪足。扫描电镜放大4000倍,AGS表面黏附的H.pylori数量为:24.2±11.5,AGSezrin细胞表面黏附的H.pylori数量为:51.4±13.1,显著多于AGS细胞(P<0.05);③AGS细胞的黏附率为(76.2±11.7)%,AGSezrin细胞的黏附率为(90.5±7.6)%,二者比较(P<0.05),差异显著,10:1比例H.pylori感染AGS及AGSezrin细胞,黏附率分别为(61.8±8.5)%,(92.4±7.3)%,H.pylori感染AGS组细胞黏附率与AGS组比较,显著下降(P<0.05);⑤侵袭实验中200倍镜下平均每视野AGSEzrin细胞的跨膜数为27.67±4.50,与AGS细胞125.50±8.33比较差异显著( P< 0.05), AGSezrin细胞+H.pylori,跨膜细胞数为31.25±6.10,与AGSEzrin细胞比较,无显著差异; AGSezrin的迁移距离明显小于AGS细胞的迁移距离。而H.pylori感染对AGSezrin细胞迁移无明显影响;H.pylori感染的AGSezrin细胞在失巢生存率略低于PBS对照组,但无显著性差异(P>0.05);⑥H.pylori感染增加AGS细胞ezrin、CD44的表达,但对AGSezrin细胞无明显影响。结论:1、H.pylori可促进胃癌的侵袭和淋巴结转移;2、ezrin蛋白在胃癌的侵袭转移中具有重要的作用,并在多个环节中参与了H.pylori促胃癌侵袭过程;3、H.pylori可通过促进Sixl的表达而上调ezrin在胃癌细胞中的表达,从而促进胃癌侵袭。