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目的:黑色素瘤患者对靶向药物容易产生耐药是目前困扰医学界的一大难题。Library文库筛选具有高通量、省时、经济等特点。本研究中,我们利用自主构建的覆盖全基因组短链非编码RNA Library对几株黑色素瘤细进行靶向药物(Vemurafenib)耐药筛选。从药物致死剂量确定,耐药细胞建立,到高通量测序鉴别导致耐药短链非编码RNA,单片段短链非编码RNA验证,生物信息分析等几个方面对黑色素瘤耐受Vemurafenib进行探索。以期能从RNA调控层面对黑色素瘤耐药机制进行一些阐述。方法:细胞培养确定Vemurafenib对几株黑色素瘤细胞的致死剂量。同时包装大量逆转录病毒,感染大量黑色素瘤细胞。增加病毒库中短链非编码RNA多样性的同时,尽量降低同一个细胞感染病毒数,便于后续单片段验证、分析。通过加入Vemurafenib进行多轮压力筛选,经过结晶紫染色、IC50检测、迁移实验、流式细胞周期、q-PCR等方法确定耐药细胞的建立。利用二代高通量测序平台Illumina Hi Seq对诱导耐药的短链非编码RNA进行鉴别,并且单片段导入细胞进行验证。此外,通过生物信息学分析和q-PCR对黑色素瘤细胞产生耐受Vemurafenib机制进行初步探索。结果:(1)Vemurafenib对Mel-888、Mel-624和A375三株黑色素瘤细胞的致死剂量均为15~25μM之间。为便于后续实验,我们把致死剂量统一定为15μM。(2)经过多轮压力筛选后结晶紫染色结果表明,感染了Library的细胞在高浓度Vemurafenib下可以存活。不管是短时间加药培养还是长时间加药培养,Mel-624v、Mel-888v和A375v细胞存活数量均比其Parental细胞多。(3)WST-1结果显示,经过Library感染筛选出的细胞的IC50明显高于其Parental细胞。甚至Mel-624v和Mel-888v相比其Parental细胞高出万倍。(4)划痕结果显示,Mel-624v、Mel-888v和A375v在横向迁移能力上均比其Parental细胞强。A375v在不加药时,横向迁移能力远远高出A375细胞。(5)Transwell结果显示,Mel-624v、Mel-888v和A375v细胞在纵向迁移能力方面也获得提升。(6)流式细胞周期显示,所有Parental细胞在加入Vemurafenib后,细胞周期均被阻滞于G1期。而Mel-624v、Mel-888v和A375v有更多的细胞进入S期和G2期。(7)q-PCR结果显示,含有Library的细胞耐药后,随机挑选的耐药基因、EMT相关基因、BRAF通路相关基因中绝大多数基因表达都明显升高。