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核酸适体作为一种新型的分子识别工具,与靶分子之间分子识别功能与抗体极为相似.但适配体作用靶分子范围极广(包括毒素、免疫原性弱及不具有免疫原性的物质),且具有核酸自身稳定性强、变性复性快速可逆、易功能化修饰与标记及作为优良的纳米器件等诸多优点.以核酸适体为识别分子的分析技术发展迅速。
信号放大技术,尤其是利用工具酶结合其他分析检测技术的信号放大技术,由于其方法简单,灵敏度和特异性高,反应时间相对较短,近年来在痕量物质分析方面的得到了迅速发展。
本文以钾离子为研究模型,基于核酸适体和荧光探针技术,发展了两种检测小分子和蛋白质检测的分析方法;并且利用工具酶信号放大技术,发展了检测单碱基多态性的新方法。从该思路出发,本文开展了一下三方面的研究工作:
1、基于核酸适体识别和芘分子荧光探针检测钾离子的研究
本章基于核酸适体和芘分子基团,研究了一种在均相中检测钾离子的简单方法。整个实验过程如下:以3’端修饰芘分子的核酸适体作为分子识别元件,而在它的互补探针的5’端修饰芘分子,当它们杂交后,形成芘激基二聚体,而在存在钾离子时,互补探针与核酸适体解链,同时伴随着485 nm处的芘激基二聚体的荧光峰降低。而在不存在钾离子时,485 nm处的荧光峰不会发生变化。通过条件优化,钾离子的检测的线性范围为8.0×10-4~1.0×10-2 M,检测限为6.0×10-4M。而且,在存在Na+、NH4+,Mg2+、Ca2+的生物流体中,仍然能对K+进行高特异性检测。
2、基于核酸适体和芘标记分子信标检测钾离子的研究
本章中我们研究了一种新颖、灵敏的基于核酸适体和芘标记的分子信标对钾离子检测的方法。同样,核酸适体做为分子识别元件,而两端标记芘分子的分子信标作为信号转换元件。在存在钾离子时,分子信标链与核酸适体解链,自身发生杂交,两个芘分子相互靠近,形成芘激基二聚体,在485 nm处产生荧光峰,荧光峰的强度与加入钾离子的量有关。而不存在钾离子时,只在395 nm处有荧光峰。在优化条件下,485 nm荧光峰的强度与钾离子的浓度在6.0×10-4M~2.0×10-2M,检测限为4.0×10-4M。在存在不同浓度Na+、NH4+,Mg2+、Ca2+情况下,对钾离子检测仍然有很高的特异性。
3、基于工具酶信号放大化学发光法检测单碱基突变
由于T4DNA连接酶可以将ds-DNA分子连接起来,而DNA聚合酶可以使DNA从5’→3’聚合。基于这这两种工具酶的特殊性质,本实验设计单碱基突变位点为T4 DNA连接酶的连接位点,如突变,则能连接上,再通过DNA聚合酶的信号放大,最终检测处化学发光信号,而未突变,则不发生连接,也不会聚合,则无信号产生。利用此方法检测单碱基突变特异性高,并且检测限可达5.0×10-16M。